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红毛菜28SrDNA与IGS序列分析及系统发育 　　摘要：为了探讨中国境内红毛菜的物种关系及亲缘关系，对红毛菜核糖体基因的28S rDNA、IGS序列进行了研究。28S rDNA序列分析结果显示：江苏（LYG、NT）、福建（NRD1、NRD2）、广东（NA1、NA2、NA3）的7个海水红毛菜遗传距离为0～0.004；而威海（WH）的海水红毛菜与其他海水红毛菜的遗传距离为0.144～0.147；山西娘子关（NZG）、甘肃兴隆山（XLS）的2个淡水红毛菜之间的关系极近，遗传距离为0.001；淡水红毛菜与威海的海水红毛菜的遗传距离（0.125）小于淡水红毛菜与其他7个海水红毛菜的遗传距离（0.210～0.213）。对江苏、福建、广东的7个海水红毛菜的IGS序列进行分析显示，7个海水红毛菜亲缘关系极近。基于28S rDNA序列的系统进化树显示，中国境内采集到的红毛菜分为3个进化分支：2个淡水红毛菜形成独立1支，而海水红毛菜则分为2个进化分支，其中威海的海水红毛菜单独为1个分支，其他7个海水红毛菜归为另1个分支。由此推测，目前为止中国境内至少存在3种红毛菜。 　　关键词：红毛菜；28S rDNA；IGS；分类学 　　中图分类号： Q968.43+9；S188+.1 　　文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）04-0066-04 　　红毛菜（Bangia）属红藻门（Rhodophyta）红藻纲（Rhodophyceae）红毛菜亚纲（Bangiaophycidae）红毛菜目（Bangiales）红毛菜科（Bangiaceae）[1]。红毛菜的形态极其简单，为直立不分枝的丝状红藻[2]。红毛菜在全球的分布极为广泛，从北半球的北欧到南半球的新西兰都有分布[3]，包括海水环境、淡水环境[4]。红毛菜的传统分类方法是根据其形态（藻体长度、直径和颜色）、染色体数目、繁殖方式、生活环境和地理分布等特征进行研究[5-6]。由于红毛菜形态结构极其相似，且易受栖息环境的影响而发生变化[5]，因此仅依据传统分类学方法已经不能满足红毛菜的分类需求，不少研究者开始从分子水平对红毛菜进行分类研究[7-8]。 　　红毛菜核糖体RNA基因序列由18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA构成1个转录单元，彼此之间被转录内间隔区（ITS1、ITS2）隔开；转录单元之间则被基因内间隔区（IGS）隔开[9-10]。核糖体RNA基因序列不同区域由于功能需要不同，承受不同的选择压力而表现出不同的进化速率，如编码区序列（18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA）具有功能需要，承受较高的选择压力而表现出较慢的进化速率，适用于种属间及以上水平的分类研究[11-12]；非编码区序列（ITS1、ITS2、IGS）则没有功能需要，承受较低的选择压力而表现出较快的进化速率，适用于种属间甚至种下水平的分类研究[13-15]。Freshwater等根据28S rDNA对红藻的13个物种进行序列分析，结果发现13个物种可以分为11目[11]，由此推测28S rDNA可能更适合用于红藻较高阶元间的系统发育研究。Pecchia等对向日葵茎溃疡病菌（Diaporthe helianthi）的18S rDNA 5′端的部分IGS序列进行分析，结果显示：来自阿根廷、法国、意大利、南斯拉夫、罗马尼亚的病菌可以分为3个独立的菌群[16]。 　　本研究首次对采自中国沿海地区、内陆地区10个不同采集地的红毛菜进行28S rDNA的分子系统学研究，分析中国境内红毛菜的物种关系。同时对江苏省、福建省、广东省的7个海水红毛菜的IGS序列进行分析，以探讨不同地区海水红毛菜间的亲缘关系。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　10个红毛菜采集地分别是山东威海（WH）、江苏连云港（LYG）、江苏南通（NT）、福建莆田南日岛（2个采集地：NRD1、NRD2）、广东汕头南澳（3个采集地：NA1、NA2、NA3）的8个海水红毛菜，以及山西阳泉娘子关（NZG）、甘肃兰州兴隆山（XLS）的2个淡水红毛菜，具体信息见表1。将采集到的材料分别用海水、淡水初步清洗后阴干，置于-20 ℃保存备用。 　　1.2 DNA的提取 　　采用CTAB法对采自不同地理群的红毛菜进行DNA提取[17]，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的完整性，置于-20 ℃保存备用。 　　1.3 PCR扩增 　　引物序列如表2所示，PCR引物由苏州金维智生物科技有限公司合成。PCR反应体系为50 μL，包括：5 μL 10×LA Taq PCR Buffer Ⅱ（Mg2+Plus），5 μL dNTP Mixture （2.5 mmol/L），2 μL DNA模板，各1 μL上、