胃癌胰岛素样生长因子-2基因印迹状态检测.pptVIP

胃癌胰岛素样生长因子-2基因的印迹状态的检测 大连医科大学生物学教研室 一、基因印记的概念 是一种在基因组DNA水平对双亲等位基因特异性的修饰作用。结果导致来自不同性别亲本（父母）的同源染色体上等位基因存在功能上的差异。 驴马正反杂交实验结果 公驴 — 母马 公马 —母驴 ? 骡 駃騠 基因组印迹现象最早由Helen Crouse于1960年在昆虫研究中首次提出。 Sciara昆虫的两条X染色体 1980年，Cattanach等人发现，具有两条母源11号染色体的小鼠在胚胎期比正常小鼠小，而具有两条父源11号染色体的小鼠在胚胎期比正常小鼠大。但是，这两种小鼠胚胎都无法正常发育而死于发育阶段。 1984年，McCrath等人用人工单性生殖的方法产生了两种特殊类型的小鼠胚胎：一种小鼠胚胎的全套染色体全部来自雄性亲本，另一种小鼠胚胎的全套染色体全部来自雌性亲本。但两类小鼠均在发育期死亡。 1991年，Dechiara等人做了小鼠IGF-2剔除基因的实验，首次证明了生物体本身带有基因组印迹基因。 ? 实验发现，敲除父源IGF-2等位基因小鼠发育成成体个体小，但若剔除的等位基因来自母源，动物的个体没有变化。 直至1993年，Feinberg实验室首次发现了基因组印迹也存在于人类。 二、基因组印迹与肿瘤的关系 IGF-2作为印迹基因，在正常人群里，只有父系的等位基因表达，母系的等位基因则处于静止状态。? 约有40%WT的患者肿瘤组织中发现有IGF-2等位基因父母系共同表达。这种静止的基因被重新活化表达的现象，称作LOI（Loss of imprinting）。 结肠癌患者也可检测到IGF-2的LOI现象，而且这种现象不仅存在于癌组织，也存在于癌旁组织和病人的血细胞中。由此被认为这种现象很可能成为该病早期诊断的指标。 ? 此外，已经发现与基因组印迹异常有关的肿瘤还有肝癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、神经胶质瘤、前列腺癌等等。 目前已经被证实与人类肿瘤发生相关的印迹基因除IGF-2外，还有WT1、P57KIP2、P73、NOEY2以及M6P/IGF-2R等等。 三、IGF-2基因 LOI的检测方法 1、DNA水平筛选杂合子 2、RNA水平观察杂合性是否完整 酶切位点：GGGCC|C GTGCCC C|CCGGG CACGGG 杂合子的鉴定可以通过PCR产物酶切后电泳的方法完成 GG TT GT LOI的鉴定可以通过杂合子RT-PCR产物酶切后电泳的方法完成 一、实验安排 实验一 基因组DNA的提取 【基本原理】 常规酚/氯仿抽提法提取基因组DNA的原理在于用蛋白裂解液和蛋白酶将组织充分消化后，再应用酚/氯仿将蛋白质变性，而核酸则溶于水相，再在一定浓度的盐和无水乙醇的作用下将核酸从水相中析出。 【器材】 1．电子天平；2．匀浆器；3．EP 管 ；4．冰盒；5．手套；6．高速离心机 【试剂】 1．酚；2．氯仿；3．无水乙醇；4．75% 乙醇；5．纯水 【操作步骤】 实验二 组织总RNA的提取 【基本原理】 组织中的RNA主要分布在胞浆中，包括mRNA、tRNA 和 rRNA 三种。mRNA 含量最低，半衰期短，易于降解。在 RNA 的提取过程中，主要采用强变性剂，如异硫氰酸胍等破坏细胞结构，失活RNA酶。细胞碎片、蛋白质等经酚、氯仿等有机溶剂抽提被去除。真核生物中18S rRNA、28S rRNA 经琼脂糖电泳后，在紫外灯下可观察到两条清晰的条带。 RNA提取关键: 防止内源性和广泛存在的外源性RNA酶，如器皿、试剂和手上等存在的RNA酶对核酸的降解作用，所用材料、器皿均需经DEPC处理（包括0.1% 溶液浸泡过夜，蒸馏水冲洗及高压灭菌15 min去除残存的DEPC）。 【器材】 1．电子天平；2．匀浆器；3．EP 管 ；4．冰盒；5．手套；6．低温冷冻高速离心机 【试剂】 1．TRIzol试剂（Invitrogen/GIBCO BRL）；2．氯仿；3．异丙醇；4．75% 乙醇；5．0.1% DEPC处理水 【提取RNA操作步骤】 实验三 反转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 【基本原理】 PCR是体外扩增DNA的方法，但不能直