Folin法测定碱性蛋白酶活性课件.pptVIP

实验一 Folin法测定碱性蛋白酶活性 Folin法测定碱性蛋白酶活性 一、实验目的 了解蛋白酶活测定方法及原理，掌握其基本操作。 二、实验原理 （1）碱性蛋白酶：能催化蛋白质水解，它不仅能水解肽键，也能水解酰胺键和脂键等，因此可以利用酪蛋白为底物进行水解反应。 （2）Folin试剂：磷钨酸和磷钼酸的混合物，在碱性条件下不稳定，可被酚类化合物还原，而呈蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）由于蛋白质或者水解产物中含有具酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等），故也可呈上述反应。 本实验就是利用碱性蛋白酶水解产物中含有酚基的氨基酸的呈色反应强度来表示蛋白酶活性。 二、实验原理 （3）在一定pH和温度（40 ℃ ）下，蛋白酶液和底物酪蛋白反应，经过一段时间后，加入三氯乙酸终止酶反应，并使多余的酪蛋白发生沉淀而与水解产物分开。 过滤后，取滤液（含蛋白水解液和三氯乙酸）用碳酸钠碱化，再加入folin试剂使之显色，蓝色强度与蛋白水解产物的量成正比，在一定浓度范围内符合比尔定律，因此可以推断出蛋白酶的活性。 （4）碱性蛋白酶酶活定义为：上述实验条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸为一个酶活单位。 三、实验器材与试剂 1、实验器材 精密电子天平、分光光度计、恒温水浴锅、容量瓶、刻度吸管（或可调式移液器）、烧杯、量筒、滤纸 2、 实验试剂 folin试剂、碳酸钠、盐酸、氢氧化钠、三氯乙酸、酪蛋白、酪氨酸、 四、实验操作-- 2、酶活测定 （1）、水解反应： 先用一支试管取6毫升酪蛋白试剂放入40℃恒温水浴中预热5min。 然后取2支干净试管，在试管中先加入1.0ml碱性蛋白酶稀释酶液，置于40℃恒温水浴中预热3min，再加入同样预热过的2%酪蛋白1.0ml，立即计时，精确反应10min。 加入三氯乙酸2.0ml终止反应，混匀，置于40℃恒温水浴中沉淀15min。 用加入滤纸的漏斗过滤，收集滤液。 （2）、测定酶活： 各取1.0ml滤液到另一试管中，加入0.4mol/L Na2CO3 5.0ml，再加入Folin试剂1.0ml，混匀，置于40℃恒温水浴中20min，冷却后于680nm波长处比色。 具体见下表：