Northernblotting课件.pptVIP

RNA印迹技术 (Northern blotting);Northern blot 印迹杂交原理示意图;制备待测核酸样品;（一）RNA的提取及质量检测;（一）RNA的变性电泳;操作方法 1%琼脂糖凝胶的制备：1g琼脂糖，10ml 10×MOPS 加0.1%DEPC水至90ml，微波炉煮沸5min使胶溶解， 冷却到50℃，加入5mg/ml溴化乙锭5ul，混匀后倒入 平板。 RNA样品处理：取10-20ug/ml的总RNA 1ul，加入 15ul上样缓冲液溶解RNA， 95℃加热2min，使RNA 变性后，迅速放置冰浴。 用20ul的加样枪将样品依次加到样品孔， 1×MOPS 作为缓冲液，恒压3-4V/cm，3h后在紫外灯下观察结 果。 ;RNA琼脂糖凝胶电泳;（三）RNA的转膜;Transfer system for Northern blot analysis ;核酸分子杂交;核酸探针的类型 （1）基因组DNA探针 :为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。 （2）c DNA探针:以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。 （3）RNA探针:以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。具高杂交效率，但易于降解和标记方法复杂。 （4）寡核苷酸探针 ;探针的标记;2. 非放射性标记物:常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物素（biotin）、荧光素。特点： 敏感性不如同位素标记 稳定性和分辨率高 检测时间短 操作简便 不需特殊的防护设备  不存在放射性污染;1、随机引物法（random priming） 利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。 将6-8寡核苷酸片段与已变性的DNA单链或RNA模板退火，使该片段随机互补结合在单链分子上，在大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段作用下，以同位素标记的dNTP为原料，寡核苷酸为引物的3’-OH端开始沿5’至3’方向，合成一条与模板互补的新DNA链。; 2、切口平移法胰DNA酶I在DNA双链上随机切开若干切口，切口处形成3’-OH末端。大肠杆菌DNA聚合酶I以切口处开始作用， 以另一条DNA链为模板。4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5’端核苷酸和3’端修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移。生成的两条链都被同位素均匀标记。;3、末端标记法 末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的5’端或3’端的一类标记法。 5’端标记法 3’端标记法;（1）5’端标记法???T4噬菌体多苷酸激酶） 用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链5’末端的磷酸基团，使其成为5’-OH，然后在（γ-32P）ATP存在下，经T4噬菌体多苷酸激酶催化，将γ位上的32P转移到DNA或RNA分子的5’-OH末端，使DNA片段或RNA或寡核苷酸5’端均带32P标记。;;（2）3’端标记法（大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段） 大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段有5’→3’DNA聚合酶和微弱的3’→5’外切酶活性，但无5’→3’外切酶活性。对残缺3’末端可进行标记。;;（三）核酸的固定;（四）杂交;2、杂交 将标记好的探针于 100℃煮沸 10～15分钟， 立即放冰浴冷却 10分钟。用杂交液稀释成所 需浓度。 将杂交袋中预杂交液倒出，加入 10ml 新鲜 的 Hyb杂交液（65℃预热，已加入变性的探 针)，小心排尽气泡，封口，放 65℃水浴振荡 杂交过夜。 ;3、洗脱 杂交完成后，取出杂交膜，放入装有 20mL 的 2×SSC/0.1% SDS 溶液的平皿中，在室温下振 荡洗涤两次，每次 5分钟。 然后放入 0.1×SSC/0.1%SDS溶液(先放 50℃水 浴预热)中，50℃水浴振荡洗涤两次，每次 15 分钟。;（五）杂交信号的检测;应用;;三种印迹技术的比较