生药1121-丙种球蛋白(聚丙烯酰胺凝胶电泳制备丙种球蛋白)-邱小猛课件.pptVIP

项目三 丙种球蛋白的制备 生药1121 邱小猛 2011423237 第一组 任务1 丙种球蛋白分离制备方案的制定 Sephadex G-50分离制备丙种球蛋白 聚丙烯酰胺凝胶电泳制备丙种球蛋白 掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的原理及基本操作。 丙种球蛋白的制备 电泳——带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis)。 电泳技术——指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 应用： 1、分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等 2、分析某种物质的纯度及分子量 3、电泳技术与层析法结合可用于物质的结构分析 4、免疫电泳可提高对蛋白质的鉴别能力 电泳基本原理 盘状电泳的原理 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳是根据被分离物质所带的电荷多少及其分子的大小，形状的不同，在电场的作用下，产生不同的速度而分离的方法。 它具有分子筛效应、电荷效应、浓缩效应三重作用。 在这三重效应的共同作用下使血清蛋白中不同的蛋白质分离开来。 样品本身：带电量，分子大小，形状 电场强度：电压 电泳介质的pH和离子强度 电渗作用 影响电泳速度的因素： 试剂 牛血清样品、分离胶缓冲液、凝胶溶液、四甲基乙二胺、10%过硫酸铵（AP）、电极缓冲液、固定液、染色液、脱色液 仪器 圆盘电泳槽、电泳仪、电泳玻璃管、滴管、烧杯、刻度吸管、加样枪、注射器等。 实验器材 步骤： 装管 配胶 灌胶 制样 点样 电泳 剥胶 固定 染色 脱色 结果分析 第二次 第一次 1.装管 取一根洁净的电泳玻璃管 ，将一端垂直插入橡皮垫 2. 配胶 按右表配置胶液 并混匀。 备用。 聚丙烯酰胺凝胶电泳制备丙种球蛋白 3.灌胶及封胶 将混匀好的胶液，用滴管缓慢注入玻璃管，当加 到液面距离电泳玻璃管上口 1cm 时停止。注意 在加的过程中不要混进空气， 随即用注射器经针头沿凝胶管壁缓慢加入蒸馏水 至管满，防止氧化，室温下聚合15-20min。 聚丙烯酰胺凝胶电泳制备丙种球蛋白 4.制样 取血清30ul，加0.025%溴酚蓝5ul，20%蔗 糖65ul，混匀即可。 5.点样 等胶完全凝结后，用滤纸小心吸去表面的水层（切勿 破坏胶面的完整性）。 将制好的胶管装入电泳槽中调节高度并塞紧，然后分 别在电泳槽的上下槽体内注入电泳缓冲液，下槽的液面 应没过玻璃管的下管口及电极丝，上槽的液面应没过玻 璃管口0.5-1cm；排气泡。 用微量注射器或加样枪吸取 50μl 样品小心的加入 玻璃管内（注意不要让样品溢出管口）。 6．电泳 （ 1 ）电流电压条件 圆盘电泳：刚接通电源时，直流稳流电流强度通常为1mA/ 管，10分钟后直流稳流电流强度通常为 4mA/ 管 。 （ 2 ）电泳时间 一般约需 2.5 小时。样品中溴酚蓝电泳至距分离胶前缘约 1cm 处时即可停止电泳。 7.剥胶 电泳结束后，取下玻璃管，用带长针头的注射器（内盛蒸馏水）从浓缩胶一端紧贴玻璃管壁缓慢插入针头，一面注入蒸馏水一面缓慢旋转玻璃管。靠水流的压力和润滑作用使凝胶和玻璃管的内壁分开，待水流从另一端流出时，再慢慢将针头退出（注意操作中不要把胶条搅碎）。然后用洗耳球轻轻在胶管的一端加压，将胶条从玻璃管中缓慢滑出（置培养皿中）。