实验三、细胞色素C的制备课件.pptVIP

实验三、细胞色素C的制备和测定  9学时 一、实验目的： 1、通过细胞色素C的制备，了解蛋白质分离 纯化的一般原理和步骤。 2、掌握制备细胞色素C的操作技术及含量测 定方法。 二、 原理： 细胞色素C包括多种能够传递电子的含铁蛋白质总称。广泛存在于各种动植物组织和微生物中。它是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素C（cytochrome c，CytC）只是细胞色素的一种。它在呼吸链上位于细胞色素还原酶和细胞色素氧化酶之间。线粒体中的细胞色素绝大部分与内膜紧密结合，仅有细胞色素C结合轻松，较易被分离纯化。 细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质，每个细胞色素C分子含有一个血红素和一条多肽链。分子质量约为13000，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成，其中赖氨酸含量较高，等电点10.2-10.8，含铁量0.37-0.43%。它易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可用酸性水溶液提取。 细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子可以进行可逆的氧化和还原反应，故可分为氧化性和还原性，前者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对热、酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起某些失活。 细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上可以纠正由于细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧症状，使其物质代谢、细胞呼吸恢复正常，病情得到缓解或痊愈。在自然界中，细胞色素C存在于一切生物细胞里，其含量与组织的活动强度成正比。本实验以新鲜动物心脏为材料提取、纯化细胞色素C，制备其粗品溶液，方法简单易操作。 四、实验方法： 1、材料处理 新鲜或冷冻动物心脏，除尽脂肪、血管和韧带，洗尽积血，切成小块，放入绞肉机中绞碎（两遍）。 2、细胞色素C粗品制备 （1）提取： 称取动物心脏碎肉500克，加自来水800毫升酸化水（水预先用6-8毫升，1mol/L的硫酸酸化）。用电磁搅拌器搅拌提取，用1mol/L的硫酸调pH=4.0（需要不断调整），搅拌提取2小时。用1mol/L的氨水调pH=6.0，停止搅拌。四层纱布挤压过滤，收集滤液。 （2）中和： 用1mol/L的氨水调滤液pH=7.2-7.5，利用等电点沉淀杂蛋白，静置20-30min，使沉淀沉下。虹吸上清夜，过滤除杂质，下部浑浊液离心（4000rpm,10min）。合并得到的红色清液，测量体积。 （3）吸附： 称取人造沸石4g，加水搅拌，除去12s内不下沉的细颗粒。向柱内加去离子水至1/2体积，然后边搅拌边连续、均匀地将预处理好的人造沸石水溶液装填入柱，避免柱内出现气泡。装柱完毕，打开柱下端夹子，使柱内沸石面上剩下一薄层水。 将中和好的澄清滤液小心加到沸石上面，勿冲动沸石，使之流入柱内进行吸附，控制流出液的速度不超过5ml/min。随着细胞色素C被吸附，人造沸石由白色变为红色，流出液应为淡黄色或微红色。 （4）洗脱 吸附完毕，在柱内洗涤：依次用30ml自来水、去离子水、0.2%氯化钠溶液、去离子水洗柱。然后用25%硫酸铵溶液洗脱（流速小于1ml/min），收集红色洗脱液（洗脱液一旦变白，立即停止收集），测量体积（控制在15ml左右）。洗脱完毕，回收人造沸石，可再生使用。 （5）盐析 为了进一步纯化细胞色素C，向洗脱液中缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌，使硫酸铵溶液浓度为45%（约相当于67%的饱和度，即100ml洗脱液加17g硫酸铵），放置30min以上(最好过夜)，杂蛋白沉淀析出，过滤，收集红色透亮的细胞色素C滤液，测量体积。 （6）三氯乙酸（TCA）沉淀 按8%体积滴加20%TCA，边加边搅拌。此时细胞色素带正电荷，与其结合生成可逆沉淀析出，立即离心(4000rpm,10min),收集沉淀（若上清液仍为红色，倒出后再补加5%体积的TCA，再次离心，收集沉淀）。沉淀用少量去离子水溶解（体积不超过10mL）。 （7）透析 细胞色素C水溶液装入透析袋，对自来水、去离子水各透析30min（用磁力搅拌器搅拌），用BaCl2 检测透析袋周围的水（用试管收集流下来的透析液约1ml，滴加1-2滴BaCl2试剂至试管中。摇匀若无白色沉淀，表示透析完全）。过滤除去不溶物质，得到细胞色素C的粗品液，量体积，测定其含量。 半透膜袋 蛋白质溶液 透析液 磁棒 磁力搅拌器