《珊瑚海绵共生放线菌的分离分类及初步鉴定》毕业学术论文.docVIP

珊瑚海绵共生放线菌的分离分类及初步鉴定 摘要： 关键词 由于海洋放线菌能够产生结构新颖、功能多样的次生代谢产物,成为新药来源的重要生物资源。 CaCO3 0.02g，Na2HPO4 0.5gMgSO4·7H2O 0.5g， KCl 1.7g核黄素0.5mg硫胺素0.5mg，维生素B6 0.5mg，烟酸 0.5mg， 肌醇0.5mg，泛酸0.5mg，生物素0.25mg，对-氨基苯甲酸0.mg），蒸馏水500ml，陈海水500ml， 琼脂MgSO4·7H2O 0.05g，CaCO3 0.02g，FeSO4·7H2O 0.01g，·3H2O 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCI 20g，蒸馏水1L，琼脂20g，PH 自然 Raffinose-histidine medium：raffinose 10g，L-histidine 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，K2HPO4 1g，蒸馏水500ml，陈海水500ml，琼脂20g，PH7.0-7.4 抑制剂：放线菌酮50mg/L，制霉菌素50mg/L，重铬酸钾50mg/L，萘啶酮酸20mg/L， 1.3 菌株平板纯化及活化培养基 ISP2：酵母浸粉4g，麦芽浸粉10g，葡萄糖4g，蒸馏水500ml，陈海水500ml，琼脂20g，PH7.3 1.4试验方法 1.4.1分离方法 称取海绵或珊瑚组织样品1g加入少许无菌海水，清洗两次，将样品转移至无菌研钵，加少量的无菌海水（10ml）研磨成浆液，再将浆液转入离心管，取1ml浆液稀释到10倍，100倍，每个稀释度分别取0.1ml稀释液涂布分离培养基，270C培养1-4周，挑取明显分开的放线菌单菌落，在ISP2平板上划线纯化后，挑取单菌落于20%的甘油中-200C保藏。根据菌落形态，显微镜下菌丝及孢子特征进行初步鉴定。 1.4.2菌株初步鉴定 菌株形态特征鉴定。接种分离出的菌株至燕麦培养基上，将灭菌的盖玻片斜插入平板，280C下培养，分别于7，14，21d观察记录培养基内菌丝，气生菌丝和可溶性色素的颜色变化，并将盖玻片取出，在光学显微镜下观察基内菌丝，气生菌丝的形态，用电子显微镜观察孢子丝及孢子的特征。 菌株的16S rRNA基因序列分析 按照文献中的方法，用Chelex-100提取已分离出菌株DNA，PCR扩增16S rRNA基因，PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。16S rRNA基因测序后，利用EzTaxon 在线比对服务（http://www，/）经行相关有效种的相似性搜索，确定菌种的属种，并下载相关菌种的16S rRNA基因序列，用Biotedit软件经行序列比对，随后用Mega4.0软件构建系统发育树。 1.1.2 试剂与仪器：Chelex-100 由北京天根生化科技有限公司提供，PCR 所用的 2×Easy Taq PCR SuperMix 由北京全式金生物科技有限公司提供。引物ITS-1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS-4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′由北京全式金生物科技有限公司合成。PCR 仪是 PE-9600 型 PCR仪。电热恒温水浴锅是天津民利科学器材厂的YY91037-1999 型恒温水浴锅。 1.1.3 培养基：土豆培养基（1L）：土豆 200g，葡萄糖 20g，琼脂 20g，pH 自然。 1.2 方法 1.2.1 菌体准备：用无菌接种环从固体培养基上挑取绿豆大小菌苔于无菌的 1.5mL Eppendorf 管中，加入少量液氮，稍加研磨。 1.2.2 Chelex-100 法提取基因组 DNA：在装有研磨好的菌体的 Eppendorf 管中加入 0.5mL 10%（w/v）的无菌 Chelex-100 溶液，在旋涡混合器上振荡 5s，沸水浴 10min，冷却至室温后 12,000r/min 离心15min。转移上清-20℃保存备用（上清即可作为 PCR的模板）。 1.2.3 rDNA-ITS 扩增：将提取的基因组 DNA 作为模板进行 PCR 扩增。50μL 反应体系包括：2μL DNA原液，25μL2×EasyTaq PCR Super Mix 溶液，引物各2μL（20μmol/L），ddH2O 19μL。反应在 PE-9600 型PCR 仪上进行，程序为：95℃变性 3min；94℃变性 1min，55℃复性 1min，72℃延伸 1.5min；进行 35 个循环，72℃延伸 10min。取5μL PCR 产物在 2%琼脂糖凝胶100V 电泳，260nm 紫外灯下观察并照相。 2 结果与分析 选取从海洋珊瑚海绵中分离出的的 23 株放线菌的分离物（sp1206-Bco2