第3章 蛋白质研究技术课件.ppt

亲和层析（affinity chromatography） 膜蛋白的分离 膜蛋白与脂质膜的结合大致有如下方式：①以α螺旋一次跨膜 ②多次α螺旋跨膜 ③多个β折叠构成的穿膜通道 ④以一段α螺 旋平行锚定于膜上 ⑤与膜脂质共价结合而挂在膜上。 ?蛋白质从质膜中分离时，暴露出来的疏水区相互作用，引起蛋白质聚集、沉淀. ?去污剂（detergents）是一种两亲分子，能嵌入到磷脂双层（phospholipid bilayers）中，破坏质膜。其疏水部分与烃基结合，亲水部分与水结合，因此可以增溶（solubilization）脂质和蛋白质. 几种去污剂 去污剂包括两类： 非离子型（nonionic detergents）如Triton X-100、辛基葡萄糖 离子型（ionic detergents）如脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸纳 ?低浓度时，去污剂以游离形式存在于溶液中。随着浓度的增加，它们聚合在一起，形成微团（micelles）. ?微团很小、圆球状聚集物。其亲水部分向外，疏水部分向内。 临界微团浓度（critical micelle concentration，CMC）：去污剂开始形成微团时的浓度，为去污剂的特征常数 ?离子型去污剂除了能与膜蛋白的疏水区结合外，还能结合水溶性蛋白质的疏水核心。由于它们带电，所以能够破坏蛋白质中的盐键和氢键, 使蛋白质变性。 ?非离子型去污剂在不同的浓度有不同的作用方式 ?浓度较高（ CMC）时，与磷脂、膜蛋白一起形成微团. ?浓度较低（CMC）时，虽然不形成微团，但仍能与大部 分膜蛋白的疏水区结合，起增溶作用. ?大部分膜周边蛋白（peripheral protein）通过离子键或其他弱键与特定的膜蛋白结合，因此可用高浓度的盐或能与二价阳离子（如 Ca2+）结合的试剂进行分离。 ?大多数膜周边蛋白是可溶性的，不能用非离子型去污剂增溶。 第二节 蛋白质的鉴定 一、分子量测定 二、等电点测定 三、末端氨基酸残基测定 四、蛋白质分子中的糖链 五、蛋白质分子中的脂 　 一、分子量测定 Ⅰ.渗透压（osmotic pressure） Ⅱ.沉降平衡（sedimentation equilibrium） Ⅲ.凝胶过滤层析（gel fitration chromatography） Ⅳ.SDSⅤ.激光解吸电离飞行时间质谱（LDI-TOF-MS） Ⅰ. 渗透压（osmotic pressure） ?同时测定几个不同浓度的渗透压，以π/ c 对 c 作图并外推到蛋白质浓度为零，得截距，从而求出 M。 ?为避免 pH 值的影响，在溶解度允许的范围内，尽量采用等电点或接近等电点的缓冲液，并增加溶液中无机盐的浓度。 ?可以测分子量在 1－10万范围的蛋白质。 ?实验装置简单，准确度高。但不能区别溶液中蛋白质分子是否均一。 公式：π/c=RT /M +Kc π：渗透压 c：溶质浓度 R：气体常数 T：绝对温度 M：分子量 Ⅱ. 沉降平衡（sedimentation  equilibrium） ?用较低的速度离心（8,000-20,000 r/min） ?离心开始后，颗粒发生沉降，造成浓度梯度，同时产生扩散作用。扩散力与离心力作用方向相反，相互平衡 公式： M = 2RT ln(c2/c1) (1-v ρ) ω2 (x22-x12) x：蛋白质界面到旋转中 心的距离 c：x处的蛋白质浓度 ρ；溶剂的密度 ω：角速度 v：蛋白质的偏微比容 Ⅲ. 凝胶过滤层析（gel fitration chromatography） 公式：log M = K1-K2Ve Ve：洗脱体积 ?先测出几种标准蛋白质的Ve ，以它们的 log M 对 Ve 作图得一直线，再测出待测样品的 Ve ，即可从图中确定蛋白质的分子量. ?样品可以是不纯的。只要它具有专一的生物活性，借助活性找出洗脱峰位置，确定它的洗脱体积就能测定它的分子量. Ⅳ. SDS公式：logM = K1-K2 μR 样品迁移距离 μR（相对迁移率）= 前沿（染料）迁移距离 以几种标准单体蛋白质分子量的logM对其μR值作图， 根据待测样品的μR ，从标准曲线上查出它的分子量 Ⅴ. 激光解吸电离飞行时间质谱（laser desorption ioni