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國科會成果報告 計畫名稱：薑黃素於移植醫學之應用(III) ：(1)淋巴球交 配反應 及細 胞素表現(2)預防慢性異種移植排斥及治 療急性排斥 計畫編號：NSC90-2314-B002-447 主持人：闕士傑 共同主持人：賴明坤 所屬受補助單位：台大醫院泌尿科 執行期間 90/08/01-91/07/31 摘要 本計畫主要探討異體移植抗排斥藥物環孢靈(CsA)合併薑黃素(CCM)之後對器官移植預 後之改善。實驗結果就以三項表現為主：一、動物移植器官存活，二、細胞素反轉聚合鏈 反應 RT-PCR 檢測基因表現，三、淋巴交配反應。 實驗結果：一、動物器官移植 薑黃素對異體心臟移植之體內免疫抑制效果是以大鼠(Brown Norway (heart) to WKY (host))來進行。本計畫中單獨使用薑黃素或是合併次治療劑量環孢靈並監測異體移植心臟 存活的平均天數，觀察基準以心跳博動為準。黃素單獨使用時，顯著地延長平均存活天數 (MST+/-SD)至 20.5+/-7.8 (100 mg/d x 14 d 組) 附圖一，及 24.5+/-6.3 (100 mg/d x 28d 組) 附 圖二 ，相較於不給藥控制組的 9.1+/- 1.9 日。合併投與薑黃素及次低劑量環孢靈(10 mg/kg/d x 7d)更使存活天數之延長比兩藥單獨使用(28.5+/-5.1 及 35.6+/-5.9 天)效果還佳， (P 0.05). 。在 BUF x WF 模式，薑黃素單獨使用並未延長平均存活日，但當次劑量環孢靈 合併投與，則接近三分之二移植鼠可存活 60 天以上，達長期存活 (P 0.05) 附圖三。 實驗結果：二、細胞素基因調節 適當大小組織以液態氮急速冷凍之後磨成粉狀再加入 Trizol 試劑，轉移 Trizol 混合液 到 1.5 離心管並在室溫下放置 10 分鐘。若有不溶物應先去除，加入 chloroform 劇烈混合後 以 1.2K 離心 10 分鐘。收集上層水層到新離心管加入 2-propanol 混合並靜置-20 度 C 10 分 鐘。以 1.2K 高速離心 10 分鐘後再用 70% alcohol (DEPC)洗過。除去酒精之後風乾並以 100% formamide 溶解，儲存在-70 度 C 。反轉錄-聚合鍊反應取用現成試劑以特定引子在 50 度 C 進行 30 分鐘反轉錄反應隨即進行聚合鍊反應。結果使用 2%瓊脂進行分離，並用標 準分子量標記估算。所有進行的細胞素表現結果如圖四。 實驗結果：三、淋巴交配反應 以單向淋巴球交配反應(one-way MLC)評估薑黃素之免疫抑制效果，從手術取下新鮮 脾臟，尼龍網篩出組織細胞液，以密度分層離心法分離淋巴球 ，以mitomycin-C 去活化之 5 n 5 刺激淋巴球(1*10/孔密度)BrownNorway(BN, RT1 ) 與接受者淋巴球(1*10/孔密度) WKY u 3 (RT1 ) 共同培養於一系列遞增濃度下之環孢靈(0 to 1.0*10 ng/ml ）與薑黃素(0 to 50 M ） o 3 之 RPMI1640/10% FCS 96 孔培養盤 37 C; 5 % CO2 中 144 小時後，加入 1Ci [ H] thymidine ，再6 小時後收取淋巴球 ，以閃爍記數儀測量 cpm 作為細胞增值指標。實驗重複 三次以上以平均值/標準差表示。 薑黃素可抑制此兩種組織不相容品系鼠 MLR 反應 ，並呈現濃度依賴性 。 （ED50=1.44M ），此外薑黃素各濃度下之環孢靈並存於培養液時有相乘效果(synergistic 3 suppressions) 。例如，MLC 反應中[ H] thymidine 結合之閃爍記數值於 10 M 薑黃素及 50ng/ml 環孢靈抑制至 (5415521 cpm) 相較於任一藥劑單獨使用; 10 M 薑黃素 (8