非梗阻性无精子症患者睾丸生精细胞体外培养后受精能力的研究.docVIP

非梗阻性无精子症患者睾丸生精细胞体外培养后受精能力的研究 　　【摘要】目的：探讨非梗阻性无精子症患者睾丸生精细胞体外培养后的受精能力。方法：选取8例非梗阻性无精子症患者的睾丸组织制备成生精细胞，经体外培养后得到长形精子细胞显微注射到卵细胞内，观察其受精情况。结果：8例患者睾丸生精细胞经体外培养后均有不同程度的分化、成熟。将培养后接近成熟的精子细胞通过显微注射到卵细胞内，卵细胞受精率为4.52%，荧光原位杂交试验结果显示卵细胞有受精。结论：非梗阻性无精子症患者睾丸生精细胞经体外培养后有潜在的受精能力。 　　【关键词】无精子症；生精细胞；体外培养；显微受精；荧光原位杂交 　　自20世纪90年代以来，睾丸生精细胞的体外培养技术已有一定程度的进展，可将人类睾丸生精细胞在体外培养到接近成熟[1]，但未见对培养后其受精能力的报道。现对人类非梗阻性无精子症患者的睾丸生精细胞在体外培养，将培养后接近成熟的精子细胞通过显微注射到卵细胞内后观其受精情况，报道如下。 　　1材料与方法 　　1.1对象 　　选取经睾丸病理活检确诊为非梗阻性无精子症患者8例，年龄23～36岁；第二性征（胡须、喉结、阴毛生长）发育良好2例，发育不良6例；睾丸5～10mL，平均（7.56±2.25）mL，血清卵泡刺激素（FSH） 13.25～32.49IU/L，平均（21.35±9.62） IU/L；血清黄体生成素（LH） 7.56～16.58IU/L，平均（12.52±3.47） IU/L。 　　1.2主要仪器、试剂 　　显微注射操作仪（Olympus）、荧光原位杂交仪（Thermabrite）和细胞培养基（Sigma）、胰蛋白酶溶液（上海）、EDTA溶液（武汉）、胶原酶溶液（上海）、CO2培养箱。 　　1.3方法 　　1.3.1睾丸组织的获取8例非梗阻性无精子症患者的睾丸组织通过睾丸活检获得，组织置于HTF中送回实验室。按本室建立的方法[2]获取睾丸生精细胞和支持细胞。 　　1.3.2生精细胞的体外培养方法睾丸组织分离后按本实验室建立的方法培养[3]。 　　1.3.3卵胞浆内精子细胞显微注射在显微镜下选择培养了5d后获得的长形精子细胞，采用显微注射技术将长形精子细胞注入卵母细胞的细胞质中，置于HTF1026培养液的微滴中在培养箱中继续培养。 　　1.3.4荧光原位杂交试验使用双色DNA荧光标记探针（CEP X、Y）分别对未受精卵和ICSI后的受精卵进行原位杂交分析，具体操作参照文献[4]。样品逐枚滴于多聚赖氨酸防脱玻片上，并对相应位置进行标记，便于探针杂交及荧光分析。玻片经洗涤、低渗、固定处理后，使用含2.5 mmol/L DTT的 1×PBS处理20 min使染色体去凝集，2×SSC洗涤和乙醇脱水风干，60℃烤箱中烤片2.5h，染色体和探针变性杂交、洗脱、DAPI复染。使用荧光显微镜的WU、WIG和WIB滤光片分别观察样品内的荧光信号，并进行摄像及记录分析。荧光信号判定：绿色荧光信号为X染色体，红色荧光信号为Y染色体。 　　2结果 　　2.1生精细胞体外培养的结果 　　本研究中，睾丸组织经酶消化后在显微镜下可观察到未成熟的生精细胞，包括有精原细胞、初级精母细胞以及支持细胞。这些未成熟的生精细胞培养后第2至3d，在倒置显微镜下可见有圆形精子细胞出现，第5d后，见有长形精子细胞出现，经计数初级精母细胞分化为精子细胞的分化率约3.35%。 　　2.2卵胞浆内精子细胞显微注射后的结果 　　选择培养获得的长形精子细胞，分别注射到47个MⅡ期的卵母细胞胞浆中，其中观察到有2个卵母细胞出现2个雌雄原核和2个极体，受精率为4.26%。 　　2.3荧光原位杂交分析结果 　　经荧光原位杂交分析，观察未受精卵5个，在荧光激发后只观察到1个绿色荧光标记，说明只存在X染色体而无Y染色体；观察出现受精的两个受精卵，其中1枚显微注射后受精卵内含有2个绿色荧光标记，另一枚显微注射后受精卵内含有1个绿色荧光和1个红色荧光标记，荧光原位杂交分析结果表明两个卵细胞已经受精。 　　3讨论 　　人类生精细胞在体外培养后能获得进一步的分化和成熟。Hasegawa等已能将初级精母细胞培养到精子细胞阶段，精子细胞能进一步变形成长形精子细胞[5-7]，有些精子细胞出现鞭毛，直至获得成熟的精子[8]。本研究中，生精细胞在体外培养后可从初级精母细胞分化到精子细胞分阶段，分化率约3.35%，而且精子细胞可变形为长形精子细胞，这一研究结果与国外研究相比较，其分化率仍较低，虽然比本室以往的结果[3]有所提高，但仍有待进一步改善培养技术，以获得更好的结果。 　　随着生精细胞体外培养技术和生殖医学技术的迅速发展，人们已能进行卵胞质内圆形精子细胞注射术（round spermatid