成骨细胞培养.docVIP

成骨诱导液： 地塞米松，β-磷酸甘油，维生素C， OB或3T3-E1：α-MEM+10%FBS+50ug/ml?ascorbic acid+10mM β-glycerophosphate PG(磷酸甘油)和Vc配好放四度， Vc尽量分装保存，减少与空气接触， 三种分开配，不能配一起，培养液也是现用现配 成骨细胞分离培养：无菌条件下取出新生鼠的颅盖骨，置入冷PBS中，剔除附着的结缔组织。用PBS液清洗3次，将其置入盛有DMEM培养基的培养皿中，剪成0.5 mm×0.5 mm大小碎块，约30块，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，置入孵箱中消化20 min，血清终止消化，弃上清液，加入1.0 g/L Ⅰ型胶原酶10 mL，置于孵箱中消化90 min，1 000 r/min离心10 min，使细胞沉淀，用PBS洗涤细胞2次，200目滤网过滤去除骨碎片。所沉淀物以含体积分数10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素的DMEM培养液重悬细胞，吹打均匀，接种至多个25 cm2培养瓶。于37 ℃，含体积分数5%CO2培养箱培养。48 h后换液，以后隔日换液1次。 成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过 程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度长至80%融合时，1∶3的比例进行传代培养。将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化