6菌落PCR-2012年分子生物学实验.pptVIP

一、正确的引物设计 引物长度和GC%含量 15-60 bp，40%-60% Tm值： Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T ) Ta=Tm - 5℃ 引物的端部 3’端起始碱基决定特异性，错配延伸效率 TG=CA 5’端碱基可呈游离状态，可被修饰（如加酶切位点，引入突变位点，插入启动子序列等） 4. 引物无回文对称结构（发夹结构） 5. 引物自身不能配对 5’----AGCT3’ 3’TCGA----5’ 引物二聚体（反应底物，与靶序列竞争酶和dNTP） 6. 二引物间不能配对 7. 二引物的Tm值相近 PCR反应的忠实性 Taq酶没有3’-5’的外切活性而不能自行校正，从而导致错掺 测序、定点诱变和克隆 减少错掺的对策： 加入Taq酶后迅速反应，避免低温下进行的链延伸；酶浓度不可过大；dNTP 不可过浓；Mg2+浓度适中 6.1.8 容易污染 防治方法： 短波紫外线照射30分钟； 器皿类可用稀酸碱泡，使碱基脱嘌呤；PCR管、枪头等一次性使用； 试剂湿热灭菌后小管分装； 加模板DNA后盖紧盖子，打开盖子前离心甩下小液滴，再慢慢打开，防止开盖过快，形成气溶胶。 每次反应都应设立阳性，阴性对照。 * 实 验 六 重组克隆子的鉴定（菌落PCR技术） 实验管(1#,2#,3#) 阴性对照管(-) ddH2O 17.5μL 17.5μL 10xbuffer 2.5 μL 2.5 μL 2.0mMdNTPs 2.0 μL 2.0 μL Primer1 1.0 μL 1.0 μL Primer 2 1.0 μL 1.0 μL Template DNA (细枪头粘菌) — Taq 1.0 μL 1.0 μL 反应总体积 25 μL 25 μL 在0.2ml Ep管(标记)中建立25×4=100μl 反应体系，再分装到PCR小管中，最后加不同的模板DNA（菌），混匀。 细枪头粘菌：镊子取细枪头,枪头粘1个菌落,然后置入EP管,用手转动枪头几圈,弃枪头。(在平板上做好标记) 循环扩增：按下述程序进行扩增 95℃ 预变性 5 min 94 ℃ 变性 45 sec 50 ℃ 退火 45 sec 72 ℃ 延伸 45 sec 72 ℃ 延伸 5 min 30 cycles 6.1.1 实 验 目 的 学习PCR体外扩增DNA原理及引物设计的原则 掌握PCR的基本操作步骤 学习和掌握菌落PCR检测重组克隆子的方法 了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响 聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction, PCR 在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增一段目的基因的技术。 6.1.2【实验原理】 以单链DNA为模板、4种dNTP为底物,在模板3’末端引物存在的条件下,利用酶进行互补链的延伸。经变性、退火和延伸多次循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。 6.1.2【实验原理】 模板DNA 引物:与被分离的目的基因两条链各自5’端 序列相互补DNA（20个左右碱基的短DNA单链) TaqDNA聚合酶 dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP） 反应缓冲液 典型PCR反应体系的组成 6.1.2【实验原理】 变性：双链DNA解链成为单链DNA 退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：以目的基因为模板,合成互补的新DNA链 (延伸时间：1kb/min) 每