全基因组重排育种技术提高豆豉纤溶酶菌产酶量-生物通.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（１０）：３９～４３ 全基因组重排育种技术提高豆豉 纤溶酶菌产酶量  梁惠仪 　郭　勇 （华南理工大学生物科学与工程学院省重点实验室　广州　５１０６４０） 摘要　枯草芽孢杆菌ＤＣ１２是从豆豉里面筛选出来的，具有纤溶酶活性的菌株。采用了全基因 ? 组重排技术提高ＤＣ１２的产酶量，首先通过对ＤＣ１２进行紫外诱变和亚硝酸诱变构建重组突变 ? ? 库，在研究其原生质体制备和再生的基础上，以其中４株诱变菌株作为直接亲本，采用电融合的方 法进行两次多亲本的全基因组重排，结合双灭活的筛选方法，共筛选出２株酶活大大提高并能稳 定遗传的菌株，使亲本菌株的酶活提高了４～５倍，最高达２７１０ＩＵ／ｍｌ。 关键词　基因组重排　灭活　电融合 中图分类号　Ｑ８１３ 　　豆豉纤溶酶是从中国传统的大豆发酵食品———豆 的随机重组于同一株菌株。 豉中发现的新型纤溶酶。这种酶不仅具有较高的纤溶 　　基因组改组技术不必要了解整个基因组的序列数 活性，而且无毒副作用，不引起内出血，在体内半衰期 据和代谢网的信息，却能优化大多数工业产物的代谢 长。因此豆豉纤溶酶无论作为抗血栓药物还是预防血 途径和表型，操作直接，时间短，非常适合于工业应用。 栓栓塞性疾病的保健食品，都具有十分重要的开发价 由于重组得到的菌株和基因修饰的有机体是不同的， 值。本课题组从传统食品豆豉中筛选出来的枯草芽孢 可以直接用于保健品和食品工业［４，５］。 杆菌ＤＣ１２，所产生的纤溶酶能高效地溶解体外血栓， 　　本文通过紫外线诱变和亚硝酸诱变构建了产豆豉 ? 具有十分重要的开发价值。由于野生型菌株的酶活偏 纤溶酶野生型菌株的突变库，在优化原生质体融合条 低，而经过多次循环诱变育种，菌株容易产生疲劳 件的基础上，以诱变菌株作为直接亲本，进行全基因组 ［１］ 重排，以提高纤溶酶的产量和活性 。 效应 。 　　基因组改组技术（ｇｅｎｏｍｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）通过传统诱变 １　材料和方法 与细胞融合技术相结合，对微生物细胞进行基因组重 排，从而大幅度提高微生物细胞的正向突变频率及正 １．１　材　料 １．１．１　亲本菌株　 由野生型纤溶酶产生菌ＤＣ１２通 向突变速度，使人们能够快速选育出高效的正向突变 ? 菌株［２，３］。具体方法是首先选择一个原始亲株，通过 过紫外诱变出来的Ｕ８，Ｕ１０和通过亚硝酸诱变出来的 经典育种法获得多个具有提高表型的菌株构建突变候 Ｎ８，Ｎ１０，枯草芽孢杆菌属。 选株文库，作为首轮多亲株融合的直接亲株，然后进行 １．１．２　菌体生长培养基　采用营养肉汤培养基。 多亲株融合，获得第一代融合株，再从中选择进一步获 １．１．３．出发菌和重组菌的发酵培养基　２％葡萄糖， 得表型提高的菌株作为第二轮融合的直接亲本，以此 ２％大豆蛋 白胨，０．２％ ＮａＨＰ０，０．１％ ＮａＨＰ０， ２ ４ ２ ４ 类推进行多轮的多亲株融合。通过对整个基因组的不 ０．０２％ ＣａＣｌ，０．０５％ ＭｇＳ０，ｐＨ７．０