凝集素芯片技术检测糖蛋白方法的建立及初步应用-生物化学与生物.PDF

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2009, 36(2): 254~259 凝集素芯片技术检测糖蛋白方法的建立及初步应用* 简强 于汉杰 陈 超 李 铮** (西北大学生命科学学院，国家微检测系统工程技术研究中心，西安 710069) 摘要 建立了凝集素芯片技术检测糖蛋白的方法，对实验条件进行了优化，应用凝集素芯片初步检测分析了Chang s liver 正 常肝细胞总蛋白中的糖蛋白糖链构成 将凝集素ConA 、GNA 固定于环氧化修饰的玻片表面，用Cy3 标记标准糖蛋白 RNaseB，利用凝集素识别特异糖链的原理建立凝集素芯片检测糖蛋白的方法 摸索出最佳封闭剂是含 1% BSA 的磷酸缓冲 液，最佳孵育时间及温度为3 h 和室温，最佳孵育缓冲液为含 1% BSA 和0.05% Tween-20 的磷酸缓冲液，并用甘露糖抑制实 验验证了凝集素芯片结合的特异性 用包含 10 种凝集素的芯片，成功解析了标准糖蛋白RNaseB、Fetuin 的糖链构成，证实 了凝集素芯片检测糖蛋白糖链的可行性 最后用凝集素芯片初步检测分析了Chang s liver 正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白糖链 构成，发现 Chang s liver 正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白可能有多价 Sia 或 GlcNAc 、terminal琢-1，3 mannose、GalNAc 、 Gal茁-1，4GlcNAc 这些糖链结构的存在 蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰，它在微生物感染、细胞分化、肿瘤转移、 细胞癌变等生命活动中起着重要作用，因此近年来蛋白质的糖基化研究受到广泛的重视，但由于缺乏一种简便、快速、高通 量的检测手段，蛋白质糖基化修饰的研究发展缓慢 凝集素芯片技术的出现实现了对糖蛋白的快速、准确、高通量的检测 分析 关键词 凝集素芯片，糖基化修饰，糖蛋白，糖组学，肝细胞 学科分类号 Q5-3 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2008.00382 蛋白质的糖基化修饰广泛地存在于各种生物体 集素芯片技术检测糖蛋白的方法，应用凝集素芯片 [1] 中，是一种重要的翻译后修饰作用 在微生物感 初步检测分析了Chang s liver 正常肝细胞总蛋白中 染、细胞分化、肿瘤转移、细胞癌变等生命活动 的糖蛋白糖链构成 凝集素芯片能简便、快速、高 [2] 中，糖基化修饰起着至关重要的作用 在病理状 通量地检测分析糖蛋白，在较短时间内给出被检测 态下，蛋白质和脂类糖基化的异常导致糖基化蛋白 糖蛋白的糖结构指纹图谱，它的出现将加速蛋白质 和糖脂中的糖链发生了结构和数量上的改变，从而 糖基化修饰的研究 改变其生物学功能 随着基因组学和蛋白质组学的 1 材料与方法 研究发展，人们已逐渐认识到糖蛋白的重要性，但 目前对于糖蛋白的研究相对滞后 目前亲和层析技 1 1 材料 术、质谱、Western blotting、糖芯片技术已应用于 玻璃片基(76 mm伊25 mm伊1 mm)购于Gold Seal 蛋白质糖基化修饰的研究并取得大量有价值的结 公司；环氧基硅烷试剂(GPTS)购自 Sigma 公司； 果，但是它们都有不足之处 亲和层析技术、质谱 凝集素 Con A 购自 Calbiochem 公司；凝集素 技术、Western blotting 耗时长，不能在短时间内获 GNA 、 ECA、 Jacalin、 LotusA、 WGA、 SNA 、 得检测结果和实现通量化 糖芯片把寡糖、糖脂或 PNA 、MAL、LCA 购于Sigma 公司；核糖核 酶 糖蛋白固定在固相支持物上以检测蛋白质或细胞与 B (RNaseB) 、胎球蛋白(Fetuin) 购于 Sigma 公司； [3～9] Cy3 荧光染料购自于GE 公司；乙醇胺购于Sigma 糖结合的性质 ，但是这种方法