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学习情境三放线菌发酵制药 子学习情境3.3  链霉素发酵 任务一 发 酵 准 备 一、发酵罐的清洗 发酵罐的清洗 从接种孔加入70L左右的清水，启动搅拌，转速为100r/min左右，用蒸汽加热清水至121℃左右，搅拌30min左右，以此清洗发酵罐。清洗完毕，利用空气压力排出洗水，并用空气吹干发酵罐。 二、发酵设备检查 检查项目： 管路连接 阀门 密闭性 仪表校正 三、发酵设备灭菌 发酵罐灭菌（空消） 灭菌压力：0.147—0.18MPa，45—60min。 注意事项： 空消后，先用无菌空气保压，灭菌的培养基、相关物料输入罐内后，打开冷却系统进行冷却。 附属设备的灭菌 分空气过滤器：发酵罐灭菌之前灭菌，灭菌后空气吹干备用。 补料系统： 补料管路：与补料罐同时灭菌，保温时间1小时。 消沫剂系统：蒸汽压力0.15MPa，保温30分钟。 消沫剂管路：与补料罐同时灭菌，保温时间1小时。 移种管路：蒸汽压力0.30—0.45MPa，保温时间1小时。 任务二 种子制备 一、培养基配制 1、孢子培养基 葡萄糖 蛋白胨 豌豆浸汁 2、种子培养基 黄豆饼粉 葡萄糖 (NH4)2SO4 CaCO3 3、发酵培养基 黄豆饼粉 葡萄糖 玉米浆 CaCO3 磷酸盐 (NH4)2SO4 二、培养基灭菌 分批灭菌的注意事项 各路蒸汽进口要畅通，防止短路逆流；罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。 排气量不宜过大，以节约蒸汽。 灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却，以避免罐压迅速下降产生负压而吸入外界空气，或引起发酵罐破坏。 在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力，否则培养基将倒流入过滤器。 连续灭菌流程 三、孢子制备 1、接种 无菌条件，接种斜面。 2、培养 将接种后的试管 放入恒温箱内， 27℃培养6d～7d。 四、种子培养 实验室种子培养的方法： 液体培养法（三角瓶摇床振荡或转式培养）； 液体深层培养： 目前几乎所有的好气发酵均采用此法 种子培养条件 温度 通气 搅拌 消泡 任务三 发酵生产 一、发酵参数控制 1、温度的控制 2、pH的控制 适合菌丝生长的pH为6.5～7.0。 适合链霉素合成的pH为6.8～7.3。 pH低于6.0或高于7.5，对链霉素的合成不利。 3、氧的控制 二、接种 从种子罐接种 三、补料控制 补料的内容 （1）葡萄糖 （2）硫酸铵 （3）氨水 四、取样 取样目的 通过定时取样获得培养过程的状态参数，以观察发酵的进行。 取样方法 打开取样管，弃去残留发酵液，收集新鲜发酵液。取样结束，取样管口通入蒸汽5min，灭菌。 任务四 发酵结束 一、发酵液的处理 1、菌体的分离方法 （1）离心分离 管式高速离心机、碟片式离心机 （2）过滤 真空过滤机、板框过滤机 2、细胞破碎 草酸或磷酸处理。 二、发酵罐的清洗 发酵结束，取出发酵液和各种电极，将发酵罐在121℃，灭菌15min。 充分清洗发酵罐内部。 灰色链霉菌对温度敏感，合适的培养 温度为26.5℃～28℃。 链霉菌的临界氧浓度：10-3mol/ml 溶氧要大于该浓度，能保证较高的 发酵单位。 LOGO Edit your company slogan LOGO 发 酵 制 药 典型的分批发酵工艺流程图 接种操作程序见下图。注意：整个实验操作过程都要非常小心，不要碰翻酒精灯，以免烧伤。 （1）用左手大姆指、食指和无名指夹住菌种试管和待接种和斜面试管，右手拧松棉塞、不取下。 （2）右手拿接种环，在火焰上烧灼灭菌，特别是箍处。 （3）火焰边取下两个棉塞，不能放下；烧灼管口一周。 （4）将接种环伸入试管内，冷却后，轻轻挑取少量菌体，立即将接种环抽出。 （6）抽出接种环后，烧管口，塞棉塞，接种环灭菌。 （5）火焰旁将沾有菌种的接种环迅速伸到斜面培养基的底部，由里向外画蛇形细线，线要画得细些。 种子扩大培养流程图 1、2-保藏种子 3-斜面 4-摇瓶 5-茄子瓶 6-固体培养 7、8-种子罐 9-发酵罐 生产车间种子培养的方法