基因工程6-表达系统与基因工程新技术(中国药科大学生物工程所有课件).ppt

高效表达目标基因的战略和技术 二、酵母表达系统 （一） 酿酒酵母表达系统 （二） 甲醇酵母表达系统 1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 2、甲醇酵母表达系统的优缺点 3、甲醇酵母表达系统操作原理 甲醇酵母系统宿主 甲醇酵母系统的整合事件 毕赤酵母系统模式表达载体 1）AOX1位点插入 2）His4位点插入 3） 多基因插入事件（串联整合） 4） 基因取代（GS115，AOX1+） 汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体 甲醇酵母系统胞内表达载体 甲醇酵母系统分泌表达载体 甲醇酵母系统分泌表达载体 4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策 1）载体稳定性 2）基因剂量 3）整合位点 5）mRNA5’端 7）分泌信号 蛋白质工程概述 一、蛋白质工程的概念 蛋白质工程(Protein Engineering)是指通过蛋白质化学、晶体学和动力学的研究，获取关于蛋白质物理、化学等各方面的信息，在此基础上，对编码该蛋白质的基因进行有目的的改造，并通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终得到比天然蛋白质更好的产物。 是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。 基因工程与蛋白质工程的区别： 基因工程通过分离目的基因重组DNA分子，使目的基因更换宿主得以异体表达，从而创造新类型，但这只能合成自然界固有的蛋白质。 蛋白质工程则是运用基因工程的DNA重组技术，将克隆后的基因编码序列加以改造，或者人工合成新的基因，再将上述基因通过载体引入适宜的宿主系统内加以表达，从而产生数量几乎不受限制、有特定性能的“突变型”蛋白质分子，甚至全新的蛋白质分子。 蛋白质工程的研究内容 蛋白质工程4大类研究： 1、利用已知的蛋白质一级结构的信息开发应用研究。 2、定量确定蛋白质结构-功能关系。包括蛋白质三维结构模型的建立，酶催化性质、蛋白质折叠和稳定性研究、蛋白质变异的探讨等。 3、从混杂变异体库中筛选出具有特定结构-功能关系的蛋白质。 4、根据已知结构-功能关系的蛋白质，用人工方法合成它及其变异体，完全人为控制蛋白质的性质。 酶绝大多数是蛋白质——天然的生物酶虽然能在生物体内发挥各种功能，但在生物体外，特别是在工业条件（高温、高压、机械力、重金属离子、有机溶剂、氧化剂、极端pH等）下，则常易遭到破坏。 需要改造天然酶，使其能够适应特殊的工业过程；或设计制造出全新的人工酶或人工蛋白，以生产全新的医用药品、农业药物、工业用酶和一些天然酶不能催化的化学催化剂。 蛋白质工程的发展 蛋白质工程是20世纪80年代处诞生的一个新兴生物技术领域。 1983年，Ulmer在“Science”上发表以“Protein Engineering‘’ (蛋白质工程)为题的专论，一般将此视为蛋白质工程诞生的标志。 当前，蛋白质工程是发展较好、较快的分子工程。这是因为在进行蛋白质分子设计后，已可应用高效的基因工程来进行蛋白的合成。最早的蛋白工程是福什特（Forsht）等在1982～1985年间对酪氨酰—t—RNA合成酶的分子改造工作。他根据XRD（X射线衍射）实测该酶与底物结合部位结构，用定位突变技术改变与底物结合的氨基酸残基，并用动力学方法测量所得变体酶的活性，深入探讨了酶与底物的作用机制。 佩里（Perry）1984年通过将溶菌酶中Ile(3)改成Cys(3)，并进一步氧化生成 Cys(3)-Cys（97）二硫键，使酶热稳定性提高，显著改进了这种食品工业用酶的应用价值。 1987年福什特通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，而导致了活性中心His（64）质子pKa从7下降到6，使酶在pH＝6时的活力提高10倍。 1988年杜邦公司宣布，成功设计并合成了由四段反平行α-螺旋组成为73个氨基残基的成果。这显示，按人们预期要求，通过从头设计以折叠成新蛋白的目标已是可望又可及了。 这显示，按人们预期要求，通过从头设计以折叠成新蛋白的目标已是可望又可及了。预测结构的模型法，在奠定分子生物学基础时起过重大作用。蛋白的一级结构，包含着关于高级结构的信息这一点已日益明确。结合模型法，通过分子工程来预测高级结构，已成为人们所瞩目的问题了。 蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。 蛋白质工程的基本步骤 1、分离纯化需改造的目的蛋白 2、了解其一级结构及高级结构，了解其结构-功能关系 3、获取编码该蛋白的基因序列 4、设计改造方案 5、对基因序列进行改造 6、将经过改造的基因序列