H5N1亚型禽 流感病毒感染性克隆构建.pptVIP

RNA干扰的历史研究和发现过程 1995年康奈尔大学Guo Su博士试图（1995）用反义RNA 去阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans） 中的par1 基因的表达时, 意外发现给对照实验组线虫注射正义RNA，不但不增加该基因的表达，反而产生与反义RNA同样的结果。 1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Fire博士和马萨诸塞大学癌症中心的Mello博士才证实Guo Su博士发现的正义RNA 抑制基因表达的现象是由于体外转录的RNA中污染了少量双链RNA 而引起。 RNA干扰的历史研究和发现过程 Fire和Mello实验表明在线虫消化道中注入双链RNA不但可以阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其子一代的同源基因沉默。他们将这一现象首次称为RNA 干扰（RNA interference，RNAi）。 RNA干扰现象随后在昆虫、锥虫、果蝇、涡虫、斑马鱼、真菌、植物拟南芥等生物及哺乳动物细胞株中也分别被发现。 RNA干扰的基本原理 RNAi在病毒研究中的应用 通过作用于病毒特定基因的siRNA抑制病毒在细胞内的复制，siRNA可作用于细胞中病毒靶受体以干扰病毒的侵染，期望达到治疗病毒性疾病的目标。 RNA干扰技术已经在多种病毒研究中得到了成功的应用：人类免疫缺陷病毒Ⅰ型、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、甲型流感病毒、口蹄疫病毒、西尼罗病毒和SARS冠状病毒等。 反向遗传学及其操作技术 禽流感病毒的复制 流感病毒反向遗传操作技术的发展历程 以辅助流感病毒为基础的反向遗传操作系统 核糖核蛋白转染法 RNA聚合酶Ⅰ方法 完全以克隆的cDNA为基础的反向遗传操作系统 RNA聚合酶Ⅰ系统:17质粒系统 RNA聚合酶Ⅰ系统:12质粒系统 双向RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ转录系统: 8质粒系统 以辅助流感病毒为基础的反向遗传操作系统 完全以克隆的cDNA为基础的反向遗传操作系统 RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ转录系统: 8质粒系统 2000年，Hoffmann等建立了RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ系统， vRNA和mRNA的合成来自于一个模板，不需要构建专门的蛋白表达质粒，为拯救病毒而构建的质粒数将大大减少。 这一系统采用共培养的293T细胞和MDCK细胞，8质粒转染细胞后， RNA聚合酶Ⅰ转录产生负链vRNA，RNA聚合酶Ⅱ合成正链mRNA 。转染的293T细胞中产生的病毒随后将感染MDCK细胞并大量复制。 RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ转录系统: 8质粒系统 双向RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ转录系统: 8质粒系统 流感病毒反向遗传操作技术的应用 利用反向遗传学操作技术研究流感病毒的致病性 利用反向遗传学操作技术研究流感病毒的生命周期 利用反向遗传学操作技术研究流感疫苗 本研究选用NP和M2基因作为RNA干扰的靶基因，针对NP和M2基因保守区段设计了5对siRNA。 研究了siRNA对基因表达的影响及其对H1N1、H5N1和H9N2亚型流感病毒在体内和体外复制的影响，筛选出能有效抑制流感病毒复制的siRNA序列，为探索RNAi技术应用于抗禽流感研究奠定基础。 2.2 研究内容 2.3 结果与分析 2.4 讨论 RNAi的设计 RNAi具有高度的基因特异性。在发夹式siRNA中，单个碱基的错配都可能会消除它的RNAi效果。因此，构建的siRNA表达质粒必须经过测序鉴定，保证与靶基因的100%同源性。 所设计的siRNA序列不应与人或其它动物基因组同源。本研究中，“看家基因”- GAPDH的检测结果显示：所选择的siRNA没有干扰转染细胞本身的基因表达和转录。 NP和M2基因作为RNA干扰的靶基因的意义 NP和M2基因是A 型流感病毒中最保守的基因，变异很小，因而选择NP和M2基因作为RNA干扰的靶基因，这样找到的能有效抑制流感病毒复制的siRNA序列对所有A型流感病毒都是有效的。 本研究的结果也显示了，能有效抑制NP和M2基因转录和表达的siRNA对A型流感病毒中不同亚型的病毒均有抑制作用，说明以NP和M2为靶基因设计的siRNA对A型流感病毒的抑制作用具有广谱性。 RNA干扰在抗病毒研究中的应用前景 依靠RNAi 技术获得病毒复制的强有效抑制的同时，不得不考虑病毒逃逸的可能性。为避免这个困难，通常采用多个必需靶位点作为联合siRNA 治疗方法，以避免病毒逃逸突变株的演化。 本研究中采用siRNA M-48+NP-1383联合使用时的效果明显优于二者单独使用时的效果，这可能也是因为联合使用时针对的是流感病毒的两个基因的靶位点，从而有效地减少了病毒逃逸的可能，增强了治疗效果。 2.5 结 论 完成了禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004 NP和M2基因的克隆，采用PCR方法缺失了M2基因跨膜区的第26－55位氨基酸 （△M2 ）。