褐飞虱组蛋白H3和H2A基因启动子克隆和序列分析.docVIP

褐飞虱组蛋白H3和H2A基因启动子克隆和序列分析 　　摘要：褐飞虱是对水稻危害最严重的害虫之一，目前缺少对褐飞虱内源高效启动子的研究。以褐飞虱的组蛋白H3与H2A基因为研究对象，通过已知的果蝇H3与H2A序列搜寻Genbank上褐飞虱表达序列标签（expressed sequence tags，简称EST）数据库，从而获得同源序列来设计嵌套引物。然后通过染色体步移的交错式热不对称PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，简称Tail-PCR）技术获得H3与H2A ATG前侧翼序列，分别为1 664、538 bp。PLACE软件在线分析TATA框、CAAT框、GATA框。为外源基因在褐飞虱细胞内高效表达以及褐飞虱转基因相关研究奠定基础。 　　关键词：褐飞虱；组蛋白H3；组蛋白H2A；启动子；Tail-PCR；基因工程 　　中图分类号： S435.112+.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）23-0030-03 　　在基因工程研究中常常需要目的基因高效表达，于是分离强启动子已成为目前基因工程的基础工作之一。高等动植物的基因调控主要是在转录水平上进行的，受各类顺式调控元件与反式调控元件协同调控。高等生物启动子主要分为3类，第1类为组成型表达启动子，这类启动子一般调控看家基因表达。组成型启动子在所有组织中都能启动基因的表达，具有持续性，不表现时空特异性；第2类为组织特异型启动子，一般调控基因在特定组织和器官中表达；第3类为诱导型启动子，一般受某种信号诱导开启基因表达，让基因在特定发育时期或特定组织器官、特定生长环境下表达[1]。其中组成型表达启动子应用比较广泛，主要应用于目的基因超量表达以及转基因研究中。看家基因别称持家基因（house-keeping genes），是指所有细胞中组成型表达的一类基因，其产物是维持细胞各种基本生命活动所必需的[2]。褐飞虱（Nilaparvata lugens Stl）是危害水稻最大的害虫之一，我国目前有1 300万～2 000万hm2 水稻受到褐飞虱危害[3]，对褐飞虱的研究成为农业病虫害防治重要课题之一。目前在褐飞虱分子生物学中缺少对其自身基因内源启动子的研究，相关研究也较少。以分离褐飞虱看家基因启动子序列为目的，用染色体步移技术得到组蛋白H2A与H3基因ATG前启动子序列，并对启动子序列进行结构与特征分析。本研究以分离组成型表达基因启动子为目的，为外源基因在褐飞虱细胞内高效表达以及褐飞虱转基因相关研究奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料与试剂 　　供试褐飞虱饲养在温室，温室的温度条件为22～28 ℃，保持合适的光照和湿度条件，以保证水稻和褐飞虱在良好环境下生长。Top 10感受态细胞为笔者所在实验室保存。Genome walking试剂盒、PMD18-T Simple Vector、DNA solution I均购自宝生物工程（大连）有限公司；PCR产物胶回收试剂盒购自美国Omega仪器仪表有限公司；其他试剂为国产或进口分析纯。 　　1.2褐飞虱DNA提取 　　褐飞虱基因组DNA提取皆为单头虫提取。所用方法为十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，简称CTAB）法参照文献[4-5]，并略有改动。将采集的单头褐飞虱放入装有400 μL质量分数为2% CTAB的 1.5 mL 离心管中，用匀浆小棒捣碎匀浆，将匀浆液放入 60 ℃ 水浴锅水浴裂解60 min，向裂解后的匀浆液中加入200 μL三氯甲烷/异戊醇（体积比为24 ∶1）抽提2次，加入2倍体积无水乙醇，-20 ℃条件下沉淀；最后将风干后的DNA溶于 50 μL TE中，置于-20 ℃条件下保存备用。 　　1.3扩增引物 　　目前褐飞虱H3、H2A序列还没有被公布，用果蝇的H3、H2A mRNA序列在NCBI的褐飞虱EST数据库中进行Blast比对，这样就获得与果蝇H3、H2A高度同源的EST片段，以EST片段序列为模板来设计引物（表1）。 　　1.4Tail-PCR扩增 　　3轮反应总体系50 μL，包括1 μL模板；2.5 mmol/L dNTPs 8 μL；10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+ plus）5 μL；LA Taq（5 U/μL）0.5 μL；随机引物与特异引物（100 pmol/μL）各 1 μL；加入dH2O至总体积50 μL。以H3第1次Tail-PCR为例，试剂盒的AP2、AP3、AP4引物分别首先与H3W1-1引物?M行第1轮扩增，扩增产物为模板再加入各自对应AP简并引物和H3W1-2进行第2轮，同理以H3W1-2和AP引物进行第3轮扩增，第3轮扩增结束