生物系统中目标蛋白分子的分离和纯化.pptVIP

* 生物系统中目标蛋白分子的分离与纯化 生物系统中目标蛋白分子的分离与纯化 三个关键问题: 目标蛋白分子病理条件下的大小可能变化。 保护措施到位，避免目标蛋白分子的技术性降解（? -70?C条件下保存，? 实验操作通常在冰浴下进行， ? 充分使用蛋白酶抑制剂）。 选择合适的分离与纯化方案。 分离纯化目标蛋白分子的来源: 一个最基本的原则是方便大量得到。 牛、猪、马、兔和鼠等动物的肝脏或其他脏器组织。 患者的手术组织标本。 培养的人或其他哺乳动物细胞。 细菌或酵母菌。 基因克隆表达。 分离纯化目标蛋白分子的方法: 盐析法。 有机溶剂沉淀法。 等电点沉淀法。 吸附法。 结晶法。 电泳法。 超速离心法。 柱层析法。 ………………。 盐析法分离纯化目标蛋白分子的原理: 蛋白质的溶解度，在低盐浓度范围随着盐浓度的升高而逐渐升高。此过程叫做盐溶(salting-in)。 当盐浓度达到一定程度后，再增加盐浓度，此时蛋白质的溶解度不是随着盐浓度的升高而升高，而是逐渐降低，在溶液中出现蛋白质沉淀析出。此过程叫做盐析(salting-out)。 不同蛋白质发生盐析时的盐浓度是不同的。这是蛋白质分子的一种特点。利用这一特点可对目标蛋白分子实施分离纯化。这种方法叫做盐析法。 - - - - - 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2 | | | | 等电点pH时，中性盐对碳氧血红蛋白溶解度的影响 离子强度（?） lg蛋白质溶解度 1.0 2.0 离子强度? （ionic strength）计算公式： ?＝? C nZn2/2。 C：各种离子的摩尔浓度，Z：各种离子的所带电荷数。 0.5MK2SO4的离子强度?＝(1 × 12+0.5 × 22)/2=1.5。 1MNaCl的离子强度?＝(1 × 12+1 × 12)/2=1。 O H H + _ + _ + _ + _ + _ ＋ ＋ _ _ O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H + _ ＋ ＋ _ _ O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H + _ ＋ ＋ _ _ O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H + _ ＋ ＋ _ _ O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H + _ _ ＋ 蛋白质盐溶过程示意图 O H H O H H O H H O H H 蛋白质分子 正负盐离子 O H H + _ + _ + _ + _ + _ ＋ ＋ _ _ O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H + _ ＋ ＋ _ _ O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H + _ ＋ ＋ _ _ O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H + _ ＋ ＋ _ _ O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H O H H _ ＋ ＋ ＋ O H H O H H _ _ _ ＋ _ ＋ ＋ ＋ ＋ _ ＋ ＋ _ _ _ _ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ _ 蛋白质盐析过程示意图 1）溶解度较低，2）溶解度变化温度系数大。 1）对蛋白氮的测定无干扰，2）廉价易得。 硫酸镁 1）溶解度较低，2）溶解度变化温度系数大。 1）对蛋白氮的测定无干扰，2）廉价易得。 氯化钠 1）30?C一下溶解度低， 2）溶解度变化温度系数大。 1）对蛋白氮的测定无干扰，2）廉价易得，3）盐析免疫球蛋白效果不错。 硫酸钠 1）对蛋白氮的测定有干扰，2）缓冲能力较差。 1）溶解度大，2）溶解度变化温度系数小，3）廉价易得，4）不易引起蛋白质变性，5）分段效果较好。 硫酸铵 缺点 优点 盐 1）溶解度低，2）溶解度变化温度系数大。 1）效果有时优于硫酸铵，2）对蛋白氮的测定无干扰，3）廉价易得。 磷酸钠 蛋白质盐析实验用盐（中性盐）