薄荷组织培养和污染控制.docVIP

薄荷组织培养和污染控制 　　 【摘 要】采用不同浓度和配比的植物激素6-BA和NAA与MS基本培养基组合。以薄荷的叶片、茎段、茎尖作为外植体进行组织培养。筛选出不定芽诱导最多的外植体取材，以及最适合进行薄荷组织培养的植物激素配比方式。结果表明：三种外植体中，茎尖的不定芽诱导数最多，出芽时间最短；其次为茎段，叶片效果最差。茎尖诱导最适培养基为MS + 6-BA 1.5mg/ L + NAA 0.08mg/L ；茎段最适培养基为MS + 6-BA 1.5mg/ L + NAA 0.02mg/ L。另外，铁离子浓度过高会抑制不定芽的生长。用饱和漂白精溶液+吐温-80处理外植体材料，可有效降低污染率。 　　 【关键词】薄荷；组织培养；污染控制 　　 　　 　　 薄荷（Mentha haplocalyx）为唇形科（Labiatae）薄荷属（Mentha），多年生宿根性草本植物。茎直立，四菱形，叶近于无柄，卵圆状，边缘具不规则细齿，有芳香气味，须根[1]。对环境适应性强，喜温暖、湿润环境。原产于南欧，我国河北、江苏、浙江等地都有养殖。薄荷全草入药，能疏散风热，清利头目。全株分布油腺，油中主要成分为薄荷酮、薄荷醇等，可用于制药、化妆品及食品制作行业。中国是薄荷油、薄荷脑的主要输出国之一。生产上多采用根茎和秧苗繁殖薄荷。但由于繁殖材料可能携带母体病毒和薄荷连年种植，依照这两种方法种植的薄荷品种逐代退化，产量和原油质量下降，进而影响市场竞争力。利用植物组织培养的方法，能够脱除病毒，且保证遗传上的稳定性[2-4]。 　　1.材料和方法 　　 实验材料 　　选用无虫害、健壮的薄荷（材料来自苗圃种植薄荷）。 　　 1.2实验方法 　　 1.2.1配制母液 　　 按下列顺序称取药品，依次溶解在蒸馏水中，配制10×大量元素母液1000ml、100×微量元素母液1000ml、200×铁盐100ml、100×维生素500ml。 　　 （1）10×大量元素母液1000ml：KNO3 19.00 g，NH4NO3 16.50g，MgSO4?7H2O 3.70g，CaCl2?2H2O 4.40g，KH2PO4 1.70g。 　　 （2）100×微量元素母液1000ml：MgSO4?4H2O 2230 mg,ZnSO4?7H2O 860mg,H3BO3 620mg,KI 83mg,Na2MoO4?2H2O 25mg, CuSO4?5H2O 2.5mg,CoCl2?6H2O 2.5mg。 　　 (3) 200×铁盐100ml: Na2?EDTA 745 mg,FeSO4?7H2O 557 mg。 　　 （4）100×维生素500ml：甘氨酸 100mg,VB1 5mg,VB6 25mg,烟酸 25mg。 　　 1.2.2实验所用生长调节剂 　　 薄荷的组织培养过程中需要用到NAA（萘乙酸）、6-BA（6-苄基氨基嘌呤）。配制NAA母液用95%乙醇或1N NaOH溶解，然后补蒸馏水；6-BA用1N HCl溶解，然后补蒸馏水。两种植物生长调节剂母液浓度均为0.25 mg/ml [5-6] 。 　　 1.2.3在基本培养基上添加不同浓度和配比的6-BA和NAA. 　　 (1)MS培养基： 　　 配制MS基本培养基1000ml：分别量取10×大量元素母液100ml，100×微量元素母液10ml，200×铁盐5ml，100×维生素10ml，于1000ml的烧杯中，再称取肌醇100mg，蔗糖30000mg，加双蒸水至1000ml。 　　 (2)加入生长调节剂，分别配制8个浓度梯度： 　　 ①MS + 6-BA 1.5mg/ L + NAA 0.08mg/ L 　　 ②MS + 6-BA 1.5mg/ L + NAA 0.02mg/ L 　　 ③MS + 6-BA 1.0mg/ L + NAA 0.08mg/ L 　　 ④MS + 6-BA 1.0mg/ L + NAA 0.02mg/ L 　　 ⑤MS + 6-BA 1.0mg/ L + NAA 0.15mg/ L 　　 ⑥MS + 6-BA 2.0mg/ L + NAA 0.15mg/ L 　　 ⑦MS + 6-BA 2.0mg/ L + NAA 0mg/ L 　　 ⑧MS + 6-BA 0mg/ L + NAA 0.1mg/ L 　　 每个梯度分别做三个重复，分装到三个三角瓶中。 　　 (3)使用1N HCl 和1N NaOH在电子PH仪上调节PH至6.0。 　　 (4)每瓶培养基中加入琼脂浓度为8%[7]。 　　 (5)微波炉煮沸培养基三次至琼脂完全溶解，用铝箔封口，121℃高温灭菌20min。 　　 1.2.4外植体的获取 　　分别剪取薄荷的叶片、茎段