一种诊断用谷氨酸脱氢酶酶学性质的研究.docVIP

一种诊断用谷氨酸脱氢酶酶学性质的研究 　　[摘要] 目的 研究一种国产谷氨酸脱氢酶的热稳定性、酸碱耐受性、最适温度、最适pH和动力学参数等性质。方法 以α-酮戊二酸、铵离子及还原型辅酶I（NADH）为底物，在谷氨酸脱氢酶催化作用下，转变为谷氨酸和氧化型辅酶I（NAD），利用NADH在340 nm处有吸收峰，监测其反应速率（-△A/min），计算谷氨酸脱氢酶的活力单位，采用Linewaeaver-Burk作图法（双倒数作图法）对谷氨酸脱氢酶的米氏常数进行测定。结果 谷氨酸脱氢酶于50 ℃保温20 min保留活力约为87.5%，而在60 ℃保温20 min后残存活力为54%；最适反应温度为45 ℃；最适反应pH为7.5；在pH为5～10范围内酸碱耐受性较好，25 ℃放置20 h残留活力为90%以上。结论 动力学研究表明该酶与国外知名厂家产品相差不大。 　　[关键词] 谷氨酸脱氢酶；酸碱稳定性；热稳定性；米氏常数 　　[中图分类号] R9 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）01（c）-0107-02 　　诊断原料用酶的性质是决定酶法试剂质量的关键，因此对临床诊断用酶的酶学性质进行研究具有重要意义[1]。谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase， GLDH ）是生物体代谢途径中一种重要的酶类，谷氨酸脱氢酶可分为NAD依赖型（EC1.4.1.2）、NAD（P）依赖型（EC1.4.1.3）及NADP依赖型（EC 1.4.1.4）。酶法尿素氮试剂用到的谷氨酸脱氢酶是NAD依赖型（EC1.4.1.2），该种谷氨酸脱氢酶一般不太稳定，只有在硫酸铵溶液中才不容易失活[2-3]。谷氨酸脱氢酶可以用于多种生化诊断试剂的配制，谷氨酸脱氢酶是配制尿素氮试剂盒（速率法）所需两种酶之一，尿素氮的含量反应蛋白的分解代谢和肾脏功能[4]。此外，谷氨酸脱氢酶还可用于血氨试剂盒和K离子试剂盒测定等[5-6]。国内有文献对谷氨酸脱氢酶的酶学性质进行过报道[7]，但是没有说明酶的出处。该文对一种国产谷氨酸脱氢酶的酶学进行研究，证明该种谷氨酸脱氢酶酶学性质符合酶法尿素氮试剂盒的原料用酶要求。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　谷氨酸脱氢酶由北京迈迪卡科技有限公司生产；NADH和α-酮戊二酸购于Sigma 公司，Tris和NH4Cl是国产生化分析纯试剂；检测仪器是Olympus AU400全自动生化分析仪器和岛津2450紫外可见分光光度计。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 谷氨酸脱氢酶活力的测定 该法以α-酮戊二酸、铵离子及还原型辅酶I（NADH）为底物，在谷氨酸脱氢酶催化作用下，转变为谷氨酸和氧化型辅酶I（NAD），利用NADH在340 nm处有吸收峰，监测其反应速率（-△A/min），计算谷氨酸脱氢酶的活力单位。反应混合液的pH为8.3，含有0.1 mol/L的Tris-Cl、0.2 mol/L的氯化铵、0.01 mol/L的α-酮戊二酸和一定量的酶液。所有酶活测定，如果未作特殊说明，反应体系温度均为37 ℃。 　　1.2.2 谷氨酸脱氢酶米氏常数的测定 采用Linewaeaver?Burk作图法（双倒数作图法）对谷氨酸脱氢酶的米氏常数进行测定。所有酶活测定，如果未作特殊说明，反应体系温度均为37℃。 　　2 结果 　　2.1 谷氨酸脱氢酶pH稳定性的测定 　　将一定量的谷氨酸脱氢酶稀释至pH为4～12的缓冲液中，25 ℃条件下放置20 h。其中，pH 4～6为醋酸缓冲液，pH 6～8范围为磷酸盐缓冲体系；pH 8～10为Tris-Cl缓冲体系，pH10～12为甘氨酸缓冲体系。然后37 ℃条件下测定残存谷氨酸脱氢酶的活力。实验表明该种谷氨酸脱氢酶具有pH作用范围广的优点，在pH为5～10范围内稳定性较好，酶残存活力在90%以上。见图1。 　　2.4 谷氨酸脱氢酶Km值的测定 　　米氏常数（Km）是酶的特征性常数，Km只与酶的种类、反应体系的pH和反应温度有关系，而与酶的浓度和底物的浓度无关。酶的米氏常数越大，说明需要的底物浓度越高，所以酶的Km数值是反应酶性质优略的重要指标。笔者利用Lineweaver-Burk作图法对谷氨酸脱氢酶催化正反应的3个底物（NN4、α-酮戊二酸、NADH）的米氏常数（3），根据直线在横轴上的截距（1/Km），求得米氏常数Km。实验表明，麦迪卡公司产谷氨酸脱氢酶的米氏常数与进口知名品牌相比相差不大，见表1。 　　3 讨论 　　诊断试剂原料用酶属于酶制剂行业的一个小分支，与工业用酶不同，生化诊断试剂用原料酶理化性质要求较高。一种好的诊断试剂原料酶应当具有条件是热稳定性好、pH稳定范围宽，Km数值较低。目前，国内对诊断原料用酶研究较少，对新的诊