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实验中的组织工程“耳”制备程序 1、将人的耳廓印下来，制成石膏软件。 2、生物材料（聚乙醇酸）形成耳廓模型。 3、取小牛关节软骨细胞，加入到耳廓模型 中，体外细胞培养 (1周）。 4、将耳模型植入到裸鼠背部。 5、4周后生长形成与人耳外形相同的“人耳”。 * * 细 胞 （组 织） 化 学 技 术 发展史： 细胞化学是研究细胞显微结构和超微结构的化学组成及其定位的科学（定量）。 研究对象是生物大分子：核酸、蛋白质、酶、多糖、脂类等在细胞或组织内的结构、分布及变化，为深入阐明细胞和异常细胞的增值与分化、遗传与发生、病理和病因等提供科学依据。 1830年比利时植物学家Raspail发表论文《在生理学重视用显微镜观察生化物质》。 1830-1870组织化学主要用于揭示生物界中的生理现象。1880-1920随着显微镜的改进和组织细胞学染色技术的发展，组织化学的概念从生理组织学转变为显微化学。 1900-1935年细胞化学技术在病理学染色方法中的应用，丰富了显微镜下证实核酸、蛋白质、酶、多糖、脂类等物质的组织化学内容。 以后发展了酶细胞化学。 20世纪50年代，电子显微镜的问世，观察细胞的超微结构。到80年代末，发展与完善了电镜细胞化学。70年代由于细胞显微分光光度法和荧光显微光度法的建立，使细胞化学的成分得以定量、形成定量细胞化学。80-90年代，流式细胞仪可对单细胞化学成分定量分析的新技术（每秒可测上万个信息）。80年代后期，创立了激光扫描共聚焦显微技术，对单个细胞进行CT分析，通过计算机进行三微立体旋转，从各角度分析细胞深层和细胞表面的各种结构。可研究活细胞和定量分析细胞内的遗传物质DNA、RNA、细胞器、酶的含量等。 ? 基本原理： 细胞中的某种化学成分和其相应的底物呈现一系列的化学反应，形成在显微镜下可见到的反应产物。对细胞内的各种成分进行定性、定位、定量研究。（特异性） 常用方法及原理： 一? 金属-金属盐沉淀法原理 利用金、银、铜、铁、钴等金属化合物与细胞化学成分反应过程中生成有色沉淀。 二 偶氮偶联法原理 用人工的酶底物，在酶的作用下产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶氮偶联法反应，形成不溶性偶氮色素。 三 过碘酸Schiff氏剂反应原理 四 多糖（糖原）+过碘酸→醛基+Schiff氏剂→紫红色化合物 显示细胞内糖类为PAS反应 显示细胞核内为Feulgen反应 ? 五 色素形成法显示酶定位的方法 某化学物质在酶作用下在细胞局部形成色素沉淀，包括四唑盐法、 联苯胺色素法、黑色素形成法等。其中四唑盐法用于定性各种氧 化还原酶、多种脱氢酶、转移酶等。 还有脱氢酶显示法、底物标记法、荧光染色与免疫荧光法、酶标抗 体法等。 具体几项细胞化学技术简介： （一）。孚尔更反应显示DNA方法(Feulgen) 用弱酸（!NHCL）水解析饱和中DNA ，打开嘌呤硷基和脱氧核糖 核酸连接的双链，释放出醛基，与Schiff试剂结合→紫红色化合物。 用显微分光光度计定量分析。 （二）。甲绿—派郎宁显示DNA和RNA 甲绿染DNA，派郎宁染RNA，它们并不是化学作用，而是与两种 核酸的聚合程度有关。 结果 细胞核的DNA绿色→兰绿色 ，核仁和胞质的RNA呈红色。 （三）。丫叮橙（AO）荧光染色显示DNA和RNA AO荧光染料与 多聚体的DNA和RNA具有亲和力。结果 细胞核的DNA亮绿色→黄绿 色荧光，核仁和胞质的RNA呈红色荧光。 （四）。多糖的显示法—过碘酸雪夫（Schiff）氏剂反应 多糖（糖原）+过碘酸→醛基+Schiff氏剂→紫红色化合物 （五）。酶的显示 1．? 碱性磷酸酶的显示（钙-钴法） 用磷酸脂为底物，被碱性磷酸酶水解后释放出磷酸基，在pH9。2—9。8条件下，磷酸基与钙形成磷酸钙（无色）+硝酸钴→磷酸钴（无色）+黄色硫化胺→硫化胺钴（黑色） 结果 碱性磷酸酶成浅灰、灰黄、灰黑色。色深者表示酶多。对照组无反应。 2．? 三磷酸腺苷酶（ATPase） ATP酶使ATP→ADP,释放磷酸基+硝酸铅→磷酸铅（黑色） 结果 ATP酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。 对照组无反应。 3．?葡萄糖-6-磷酸酶显示法（G-6-Pase） 葡萄糖-6-磷酸酶作用葡萄糖-6-磷酸酶钠（钾） 释放磷酸基+硝酸铅→磷酸铅（黑色） 结果 G-6-P酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。 对照组无反应。 ? ATPase ATPase ATPase G-6-Pase G-6-Pase G-6-Pase G-6