生物化学 蛋白质化学hiTsy1Ur.ppt

1　实验目的 掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法； 掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能； 培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质。 绪　论 * 2 通过生物化学实验应该做到 学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。 学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验。 掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。 * 3.1 实验记录 实验前写好实验预习报告(钢笔和园珠笔)。 实验中应及时准确地记录(专用纸，事先在记录纸上设计好各种记录格式和表格）所观察到的现象和测量的数据。 实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。 实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试剂的浓度等。 3 实验记录与实验报告 * 3 实验记录与实验报告 3.2 实验报告 实验报告的格式应为： ⑴ 实验目的； 　　⑵ 实验原理； 　　⑶ 仪器、材料和试剂； 　　⑷ 实验步骤； 　　⑸ 结果讨论（含数理据处）； 　　⑹ 注意事项; (7)思考题 注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。 * 4 实验成绩评分方法 实验预习情况（10%） 实验操作情况（20%） 实验报告情况（20%） 实验考试成绩（50%） * C.分子筛效应 分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的 泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。 缓冲液 浓缩胶 分离胶 * （四）等电聚胶电泳 一）基本原理 根据蛋白质分子的等电点进行分离。利用这种技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行，在外加电场作用下，各种蛋白质将移向并聚集（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个很窄的区带。是一种自由界面电泳。 二）优缺点及主要用途 加样位置和体积不受严格限制，分辨率很高，可测定pI，分离速度快，分离的蛋白质不变性。 可用于蛋白质和两性分子的分离分析和蛋白质pI的测定。 三）基本操作 1、胶的制备(需两性电解质） 2、加样和电泳 3、染色和脱色 * 等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。 + + － － － － + － － － － － 5.0 6.0 7.0 稳定pH梯度 5.0 6.0 7.0 稳定pH梯度 通电 + + － － － － + － － － － － + + － － － － + － － － － － + + － － － － + － － － － － + + － － － － + － － － － － * （七）毛细管电泳(CE) 在内径为25-100μm的石英毛细管中充填了缓冲液或凝胶后在两端加上电压所进行的电泳。 1、自由溶液毛细管电泳（FSCE) 2、毛细管凝胶电泳(CGE) 3、毛细管等电聚胶(CIEF) 4、胶束动电毛细管色谱(MECC) * 五 、透析与超滤 1.透析（Dialysis ) : 就是利用蛋白质分子不能通过半透膜，而小分子可以自由透过的性质，使蛋白质与小分子物质分开。 2.超滤（Ultrafltration ，超过滤）: 超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化 * * 三、离心技术类型 常用离心技术一般包括差速离心法和密度梯度离心法，后者又分速率区带离心和等密度离心。 （一）差速离心法 原理：采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法，称为差速离心法。 当以一定离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加上转速下再进行离心，又得到第二部分较大、较重颗粒的“沉淀”及含小和轻颗粒“上清液”，如此，多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好分开。这时所得沉淀是不纯的，需经再悬浮和再离心（2—3次），才能得到较纯颗粒。 常用于从组织匀浆中分离细胞和病毒。 * 已破碎的细胞 沉淀（细胞核