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RQ―PCR技术及的应用进展 　　摘要：传统PCR技术虽然因为其灵敏性、特异性和快速性，自发明以来取得了广泛应用，但仍存在容易交叉污染而产生假阳性及定量不准确的缺陷。而实时荧光定量PCR（RQ-PCR）技术实现了从定性到定量的飞跃，由于其操作方便、反应速度快、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。 　　关键词：RQ-PCR；荧光探针；分子生物；荧光共振能量转移 　　中图分类号：O657 文献标识码：A 文章编号：1009-2374（2013）13-0044-02 　　1 RQ-PCR技术概述 　　RQ-PCR是FPET（荧光共振能量转移）技术在PCR定量上的应用。其指在PCR反应体系中加入荧光基团，在指数扩增期间通过连续监测荧光信号出现的先后顺序及强弱变化实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。RQ-PCR同步进行定量和扩增，这样就克服了传统PCR的平台效应，减少了终点检测带来交叉污染的机会，也克服了终点法定量的不准确性。另外，RQ-PCR无需再处理，节约了时间和精力，更避免了放射性同位素可能给实验人员造成的伤害。目前，RQ-PCR在分子生物学研究中应用越来越多。 　　1.1 荧光共振能量转移 　　当一个荧光基团的荧光光谱与另一个荧光基团的激发光谱重叠，并且两个基团距离足够近时，供体荧光基团的激发能诱发受体基团发出荧光，同时供体荧光基团自身的荧光强度衰减，即能量从短波长的荧光基团传递到长波长的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。 　　1.2 参照物 　　参照物有外参照和内参照两种。外参照不与目的基因在同一反应体系中扩增。以已知浓度的目的基因为模板按一定比例稀释，制备标准曲线。而未知标本则根据该标准曲线得出相对的拷贝数和Ct值。其优点是可以和目的基因保持较高的同源性，保证了二者的扩增效率近似。缺点是不能克服也无法检测可能出现在样本反应体系中的影响因素。内参照是在各标本中加入已知浓度的内参照基因，与样本一起抽提、扩增。内参照基因的DNA片段与目的基因相似。为保证目的基因只能与内参照探针结合，运用定点突变的方法改变与探针结合的中间部位的序列。内参照系统的结果重复性更好，可以避免不同抽提效率导致的样本间差异。 　　1.3 RQ-PCR几个重要参数 　　（1）荧光域值3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍设置为荧光域值的缺省，荧光本底信号为PCR反应的前15个循环的荧光信号；（2）Ct值中C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数；（3）Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，当获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 　　2 RQ-PCR技术的关键 　　RQ-PCR技术在常规PCR基础上添加了荧光染料或探针。特异的将双链DNA掺入荧光染料中，保证其信号与PCR产物完全同步递增。在探针的3’端和5’端分别标记淬灭基团（Q）和报告基团（R），进行能量的传递。R基团所发出的荧光可被Q基团吸收或抑制；抑制作用随着两者距离变远而消失，R基团增强后的荧光信号可以被荧光监测系统接收到。当荧光信号增强到某一阈值时，Ct值被记录下来。这样，通过未知样品的Ct值和标准曲线就可以将该样品的起始拷贝数确定。因此，在RQ-PCR中，荧光染料或探针就成为了技术关键。目前已经开发出的荧光染料和探针按照能量转移和基团标记的方式，大体可以分为水解类探针和杂交类探针两类。 　　2.1 Taq Man探针法 　　在该探针的3’末端和5’末端分别标记Q基团和R基团，使其与两引物所包含的一段序列内DNA模板完全互补。当探针完整时，利用Taq酶5’→3’外切酶的活性，Q基团吸收R基团的荧光，荧光信号也就不能被检测到；相反如果正确的底物被扩增出来后，即有特异的PCR发生时，探针就会在复性阶段与其杂交，当聚合酶延伸到探针时，它就会将与模板杂交上的探针切碎，使得R基团和Q基团分开，解除淬灭作用，从而释放出荧光信号，可通过检测系统观察到信号的变化。每扩增一条DNA链，就会有一个游离的荧光分子形成，实现了荧光信号累积与PCR产物形成完全同步，进而计算出Rn值、△Rn值、Ct值和阈值。通过计算就可以获得起初模板量。常用的荧光基团是VIC、TET、FAM、HEX。 　　2.2 非特异性双链DNA嵌入染料 　　SYBR Green 1是一种与双链DNA结合的染料。当它游离在溶液中时，不发出荧光；但当其掺入DNA双链后，会发出强烈荧光。该染料最大的优点是可以作