井冈霉素高产菌株原生质体诱变筛选的研究.docVIP

井冈霉素高产菌株原生质体诱变筛选的研究 　　摘要以吸水链霉菌井冈变种k-121-5为出发菌株制备原生质体,并对其进行紫外诱变,通过筛选得到5株较为高产的菌株,经连续传代、摇瓶发酵,井冈霉素A产率比出发菌株提高14%～26%。 　　关键词井冈霉素;吸水链霉菌井冈变种;原生质体;诱变;筛选 　　中图分类号Q937文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)22-0038-02 　　 　　ResearchonScreeningofJinggangmycinstrainwithHigh-yieldbyProtoplastMutation 　　QIN jing-yu 1LI shi-jie 1LIU Hua-mei 2 　　(1 College of Biological Engineering,Hubei University of Technology,Wuhan Hubei 430068; 2 Wuhan Kernel Bio-tech Co.Ltd) 　　AbstractStreptomyces hygroscopicus var. jinggangensis Yen K-121-5was accomplished protoplasts preparation. The protoplasts were treated with ultraviolet irradiation,screened on culture plate and obtained 5 high high-yield strains. Jinggangmycin A yields of the mutation strains was 14%～26% higher than the original strain by shaking flask fermentation after series transfer culturing. 　　Key wordsJinggangmycin;Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis Yen;protoplast;mutation;screening 　　 　　井冈霉素属氨基糖苷类农用抗生素,由吸水链霉菌井冈变种(Streptomyces hygroscopicus var. jinggangsis Yen)发酵产生,能有效防治水稻纹枯病,生产成本低,高效、安全,是目前使用最广泛的农用抗生素[1-2]。井冈霉素在中国生产使用30多年,菌株的单位产量仍较低。该文以原生质体诱变的方法获得突变菌株,并从中筛选出多株单位产量较高的井冈菌株供生产使用。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　1.1.1菌株。以湖北省工业微生物重点实验室诱变筛选所得的菌株k-121-5为出发菌株。 　　1.1.2培养基。①菌丝体培养基:葡萄糖1.0%,酵母膏0.4%,蛋白胨0.4%,MgSO4?7H2O 0.05%,KH2PO4 0.2%,K2HPO4 0.4%,甘氨酸 0.7%。②发酵培养基:大米粉,豆粕粉,酵母粉以及各种微量元素。③再生培养基:蔗糖20.5%,K2SO4 0.025%,酪蛋白氨基酸0.01%,L-脯氨酸0.01%,微量元素溶液0.2%,琼脂2.5%,KH2PO4 0.005%(分开灭菌),CaCl2?2H2O 0.368%(分开灭菌)[3]。 　　1.1.3缓冲液。蔗糖 10.3%,微量元素 0.2%,K2SO4 0.025%,MgCl2?6H2O 0.203%,KH2PO4 0.005%,CaCl2?2H2O 0.368%,TES 1%。 　　1.1.4微量元素溶液。ZnCl2 0.004%,FeCl3?6H2O 0.02%,MnCl2?4H2O 0.001%,Na2B4O7?10H2O 0.001%,(NH4)6Mo7O24?4H2O 0.001%,CuCl2?2H2O 0.001%。 　　1.1.5酶液。用缓冲液配制溶菌酶液,浓度为2 mg/mL。 　　1.2试验方法 　　1.2.1菌丝体培养。将斜面保藏的k-121-5井冈霉素菌接入菌丝体培养基中,37 ℃振荡培养40 h。 　　1.2.2原生质体的制备。①将若干玻璃珠放入装种子液的三角瓶中,振荡30 min。②将振荡好的种子液分装到8支7 mL离心管中,每只装5 mL。8 000 r/ min离心10 min,去除上清液,然后加入缓冲液再离心,洗涤1次。③将装有培养完毕的菌丝体离心管中加入5 mL溶菌酶,摇匀,水浴锅37 ℃下酶解1 h,酶解过程中每间隔15 min手摇1次。④酶解完成后,离心,去除酶液。用缓冲液洗涤2次,最后用缓冲液混合均匀,用8层镜头纸过滤。