CH12-TAN 基因诊断与基因治疗培训教材.ppt

第十六章;第一节 基因诊断;二、基因诊断的内容和技术;（1） DNA序列测定 （2）核酸分子印迹杂交 （3）聚合酶链反应（PCR） 单链构象多态性检测PCR-SSCP 限切酶酶谱分析PCR-RFLP 随机引物分析 PCR-RAPD （4） DNA芯片技术 ;1、点突变的诊断 PCR结合点杂交 DNA芯片技术 限制性片断长度多态性分析法RFLP; 正常基因：设计寡核苷酸探针M GGTACGATGCGGTTAACGCG CCATGCTACGCCAATTGCGC 突变基因：设计寡核苷酸探针N GGTACGATGTGGTTAACGCG CCATGCTACACCAATTGCGC ;M N;杂交的结果：;（2）诊断未知的点突变 常用检测方法： ①PCR-SSCP ②DNA芯片 ③测序;①PCR-SSCP检测法 单链构象多态性 Single strand conformation polymorphism SSCP; 基本原理 单链DNA在中性溶液中可形成一定的空间构象，构象与其碱基顺序相关。因此当单链DNA中碱基变异时，如碱基替换，它的空间构象也发生一定变化。这种现象称为单链构象多态性。 ; 单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，其迁移率不仅与链长有关，还与单链 DNA的空间构象有关，因此碱基变异引起的构象变化也可改变单链DNA的电泳迁移率。;ssDNA;2、少数核苷酸缺失或插入突变的诊断;3、大片断缺失或插入突变的诊断 常采用PCR法; 4、基因重排（染色体易位）的诊断 常采用PCR法;5、基因扩增的诊断 常采用Southern印迹杂交定量法; 关于多态性分析 ;1、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）分析; DNA分子中某些碱基的变异（即位点多态性）可使某种限制性核酸内切酶的切点消失或出现新的切点，因此用同一种限制性核酸内切酶消化不同个体的DNA分子时，会产生各不相同的限制性片段类型。这种现象称为限制性片段长度多态性。; 限制酶酶切位点的改变造成的RFLP可分为两种情况： ① 限制酶识别位点发生单个碱基置换，导致酶切位点消失或获得，此称为点多态性。这种多态性只有两个等位片断，即多态位点的有或无。; ② 限制酶识别位点之间的DNA序列缺失、插入或重组，限制酶识别序列不发生变化，但它在基因组中的位置发生了变化。这种多态性可以有两个或两个以上的等位片断。;RFLP分析法 限制酶酶切图谱直接分析法 RFLP间接分析法;（1）限制酶酶切图谱直接分析法 ① 限制酶酶切—Southern印迹杂交。 ② PCR—限制酶酶切;应用RFLP诊断镰刀状红细胞性贫血;MstⅡ酶切位点;HbA;1.1kb;（2）RFLP间接分析法—— RFLP连锁分析法 甲型血友病 疾病种类：X染色体连锁性遗传病 缺陷基因：凝血因子Ⅷ基因 主要临床表现：出血性疾病; 应用PCR-RFLP连锁分析法诊断甲型血友病 用一对引物扩增凝血因子Ⅷ基因第18外显子内的一个142bp片断，该片断含一个BclⅠ多态性位点。酶解后，如果存在BclⅠ酶切位点，则产生99bp和43bp两个片断；如果不存在则只有142bp一个片断。研究证明，142bp片断与甲型血友病基因连锁。;142bp;2、DNA重复序列多态性分析;（三）基因表达异常的诊断 1、mRNA的定量分析 （1）相对定量 斑点杂交 RT-PCR （2）绝对定量; 三、遗传病的基因诊断; （一）血红蛋白病 1.异常血红蛋白病 1、DNA检测与分析 （1）PCR-限制酶谱分析法 （2）Southern印迹杂交分析法 2、RNA检测与分析 RT-PCR;镰状细胞贫血病（sickle cell aneamia）;2. 地贫 (1)?-地贫 1）DNA检测与分析 （a）RFLP （b）PCR 2）RNA检测与分析 RT-PCR;（2）?-地贫的基因诊断 1) DNA检测与分析 （1）PCR-探针法 （2）PCR-RFLP连锁分析法 （3）DNA芯片技术 2)RNA检测与分析 RT-PCR;?C地中海贫血 ?珠蛋白