PCR原理及其操作幻灯片.pptVIP

3.dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系： dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低 4.模板（靶基因target gene） 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一； 传统DNA纯化方法：采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本； SDS：是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而 破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合 而沉淀； 蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白, 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇 或异丙醇沉淀核酸提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。 临床检测标本：可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增； RNA模板提取：采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止 RNase降解RNA 5.Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响; 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200μmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜; Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR 的反应流程 温度与时间的设置 循环次数 1、温度与时间的设置 设置变性-退火-延伸三个温度点 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃退火，然后快速升温至70～75℃延伸， 对于较短靶基因（长度100～300bp）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸。 ① 变性温度与时间： 一般93℃～94℃，1min足以使模板变性 若低于93℃则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 ② 退火(复性)温度与时间： 退火温度是影响PCR特异性的重要因素 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作为选择最适退火温度的起点较为理想 Tm（解链温度）＝4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm值－（5～10℃） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 复性时间一般为30～60s，足以使引物与模板之间完全结合 引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度： ③ 延伸温度与时间： 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 常用温度为72℃ 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3～4kb的靶序列需3～4min 扩增10kb需延伸至15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些 2、循环次数 循环次数 决定PCR扩增程度 循环次数 主要取决于模板DNA的浓度 循环次数：选在30～40次之间 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多 * PCR反应原理及其操作 生物化工 韩 栋 1.PCR的基本原理 2.PCR反应体系 3.PCR的基本步骤 4.PCR反应五要素 5. PCR 的反应流程 PCR的基本原理 试管中进行的DNA复制反应，依据 DNA半保留复制的机理； 体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质； 通过人为控制体外合成系统的温度，使 双链DNA变成单链， 单链DNA与人工合成的引物退火， DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。 PCR反应体系 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 　　　　 各10～100pmol 模板DNA 　　　 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 　　　　　 1.5mmol/L PCR的基本步骤 72℃ 94℃ 55℃ PCR循环 PCR的基本步骤 1.变性：高温使双链DNA解离形成单链