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花生组织培养技术的优化研究 摘要 花生是一种优良的经济作物。利用生物技术方法在花生中导入外源优良基 因，是改良花生品质的有效方法，组织培养即是这样一种高效生物技术手段。利 用组织培养技术构建花生高频植株再生体系是花生育种的关键，但由于植株再生 率低、取材具有季节限制，并且花生的离体培养具有较大的基因型依赖性，品种 间再生能力差别较大等多种因素的制约，很难获得高效、稳定、连续的再生植株。 探索和完善高频率植株再生体系具有重要的理论和实际应用价值。 本研究以4个花生品种(普通型的大花生8130，珍珠豆型的小花生花育20， 中间型的花育14和花育16)为目标，从灭菌方式的选择、不同外植体的选择、 不定芽诱导、抗生素抑制细菌污染、壮苗、生根培养及炼苗移栽等多环节研究入 手，以优化花生植株再生体系为目的，筛选及优化花生高频率植株再生体系的构 建条件，建立和优化了花生的高频率植株再生体系，为花生遗传转化的进一步研 究奠定基础。以期为研究结果发现： 1．花生种子灭菌适宜方法为：无菌条件下，用75％酒精浸0．5一lmin，在1％次 氯酸钠中浸泡10min，进行表面消毒，最后用无菌水洗涤3—4次，每次3-5min。 这种方法灭菌效果好，对种子伤害少，负面影响也少。 2．不定芽诱导 2．1不同基因型诱导不定芽：不同基因型均能成功诱导不定芽。在基本诱导培养 2石 基B3N1中花生品种鲁花14和花育20的不定芽发生频率较高，分别为76．65 和75．81％。花育16和8130的不定芽发生频率较低，分别为52．2％和45．80％。 2．2不同外植体诱导不定芽：研究发现花生诱导不定芽的最佳外植体为萌发6d 的胚小叶，其诱导生芽率明显高于其它外植体，不定芽诱导率为75％。萌发3d 的胚小叶，长短只有卜2mm，不易切割，并且容易出现细菌污染和褐化，不定芽 诱导率为72．5％；萌发9d的胚小叶，叶片逐渐张开，芽分化能力逐渐降低，不 定芽诱导率为68．75％。上胚轴、下胚轴、子叶也诱导出少量的不定芽，其诱导 率分别为3．75％、5％、7．5％。 2．3不同激素配比培养基对不定芽诱导培养的影响：基本诱导培养基B3Nl中 AgN03浓度2mg／L的处理萌发6d的花育20胚小叶不定芽诱导率最高达85％， 玻璃化现象最低只有22．86％。诱导培养基N1在4个基因型中诱导频率都较高， 普遍达到80％以上，在N1培养基中花育20不定芽诱导率最高，达89．2％。不 同浓度NAA和TDZ和6-BA处理的T系列的培养基在花育20胚小叶的诱导试 验中表现一般，最高诱导率只有73．91％，比N1培养基表现要差。说明T系列 不是花育20胚小叶的最佳诱导培养基。 3．再生植株的壮苗、生根培养 率最高，达86．67％。可作为花育20不定芽伸长的最佳分化培养基。 3．2多效唑在壮苗及生根培养中的应用：多效唑可以有效地抑制株高，形成壮苗， 有效解决组培苗出现的苗茎细长和瘦弱等问题。当多效唑浓度是0．5mg／L时，是 合适的壮苗浓度，当多效唑浓度过大，组培苗表现生长健壮，植株矮化严重。反 而不利于壮苗。在花生生根培养基中，附加0．2mg／L多效唑效果为最好，根系发 达，移栽苗成活率高。生根培养基中多效唑浓度超过0．2mg／L时，反而降低繁殖 系数和成活率。因此，在花生组培快繁过程中，应兼顾试管苗健壮、繁殖系数高和 移栽成活率高几个方面。 3．3抗生素对细菌的抑制效应：在花生组织培养苗继代培养基中添加一定浓度的 医用抗生素可有效抑制细菌对培养基的侵染。在本实验所选用的5种抗生素中， 羧卞青霉素对污染的组培苗抑菌效果最显著，60mg／L就能达到抑菌率100％， 并且对组培苗的正常生长无显著影响，在花生组培中可以选用。 而添加卡那霉 素和利福平的处理，组培苗的叶绿素的合成明显受到影响，不建议选用。 3．4生根培养：在IR2生根诱导培养基上生根效果较好，生根率高，高达95．04 ％，根数多且长，生根部位愈伤组织小。移栽后成活率也最高，达47．31％。 4．炼苗移栽 不同基质移栽成活率比较，以沙／蛭石／土壤=1：1：1为基质的再生苗成活 率最高，高达81．67％。 关键词：花生，组织培养，再生植株，继代培养，优化技术 technicalstudieson tissueculture Optimizati