高效嗜热L-海因酶系产生菌筛选及其基因簇序列解析.pdf

摘 要 手性氨基酸，特别是用发酵法难以生产的天然、非天然或非蛋白氨基酸在医 药、食品、农业及手性药物合成等领域具有广泛的用途，作为主要制备方法之一 的L一海因酶系法制备L一氨基酸技术受到人们的普遍关注。本文综述了海因酶法制 备光学纯氨基酸的原理及应用，在海因酶多样性及构效关系的基础上，针对海因 底物溶解度低、海因酶系相关酶热稳定性较差，较大程度地限制了海因酶法制备 光学纯氨基酸技术的应用等问题，重点筛选了耐热海因酶和氨甲酰水解酶产生 菌，研究了海因酶产生菌分布特点及最佳候选菌株MH602的发酵条件、产酶条件、 酶底物特异性等，克隆了MH602海因酶系基因簇序列，解析了基因簇序列相关基 因的结构特征，进一步分析了海因酶和氨甲酰水解酶的进化地位。本文的主要研 究成果如下： (1)以DL．5．取代海因为唯一氮源、建立了PDAB显色法与酚红平板显色 法相结合的快速检测手段，从土壤样品中筛选到有较好双酶海因酶和氨甲酰水解 酶产生菌24株。这些菌株最适生长温度为45．55℃。24株菌转化DL．5．苄基海因 的产物氨基酸构型分析表明：其中17株菌生成L．氨基酸，7株生成D．氨基酸， 这与文献报道的70％以上菌株是D．海因酶系产生菌不同。推测L-海因酶系产生 rDNA序列分析鉴定结果 菌的分布可能与嗜热菌有关。经Biolog菌种鉴定和16S 表明，海因酶与氨甲酰水解酶产生菌主要分布在肋c以蝣，G8D6口c硼淞， 向例f6口c讲淞，彳门P计加汤口cf：f，淞，Mc加6口ct盯m坍，缸，历蛔等菌属中，海因酶系产 生茵在不同菌属中的分布具有广泛性。 (2)利用16SrDNA序列对海因酶产生菌的系统发育分析表明：大多数L． 海因酶系产生菌是革兰氏阳性菌，主要属于芽胞杆菌属肋c讲埘、彳刀w历汤口cf，，淞、 等。这组茵耐热性好，最适生长温度45．55℃。而大多数D．海因酶产生菌是革兰 氏阴性菌，主要分布于nP甜如历D刀田，彳．矿D6口c泐m所和B耵砌DJ『d打括等菌属中， 这类细菌的生长温度在30℃左右。海因酶与氨甲酰水解酶产生菌转化DL．5．取代 海因生成氨基酸构型与种属分布、菌株生长温度紧密相关。 (3)优化了最佳候选菌B口c川淞加脑fMH602的发酵与产酶条件，研究了酶 I 摘 要 的相关性质。最适培养基组分为QL。)：甲基海因1．6、蔗糖lO、氯化钠3、 mL 磷酸二氢钾9、硫酸镁0．25、玉米浆15 L．1，pH7．5。诱导剂甲基海因的最 适加入时间是菌体发酵到8h。该菌海因酶是胞内酶，海因酶和氨甲酰水解酶的 苄基海因为L．苯丙氨酸的最高摩尔转化率为88．6％。海因酶和氨甲酰水解酶粗酶 液分别在50℃和45℃保持6h后，残留活性几乎无损失，显示了较好的热稳定 性。双酶具有较广泛的底物谱，对芳香族海因如苄基海因、苯海因具有较高的选 择性，短侧链的脂肪族海因如海因，甲基海因次之，长侧链脂肪族海因选择性较 差。通过对转化中间体及产物的构型分析表明：海因酶是非选择性的，而N．氨 甲酰水解酶是严格L．选择性的。 (4)采用基因组步移法扩增得到MH602L．海因酶系新基因簇序列，其全长 802l bp。经Bl舔t检索分析基因簇发现5个阅读框，依次为：二氢嘧啶脱氢酶、海 因酶、转运蛋白、超蛋白及L．N．氨甲酰水解酶。二氢嘧啶酶与B口c讲淞sp．NRRI． B口c俄螂c，口淞打的L．N．氨甲酰水解酶同源性最高为45％。该耐热性海因酶与氨甲酰 水解酶基因均为新基因及相关酶基因均为新基因，海因酶系基因簇序列排列方式 与其它报道的海因酶基因簇存在较大差异，虽然具有相同的转录方向，但海因酶 和氨甲酰水解酶基因属非连续分布，被转运蛋白基因和超蛋白基因阻隔；且海因 酶和L-N．氨甲酰水解酶基因分别有明显的启动子特征区域，而已报道的L．海因酶 系基因簇序列往往共用相同的启动子，此发现可指导MH602双酶的高效诱导。将 海因酶与氨甲酰水解酶分别在大肠杆菌BL2l(DE3)中表达，进一步验证了该基因 的功能。 (5)对海因酶同源性及其进化地位进行了分析