分子荧光分光光度法实验技术-(精品课件).pptVIP

分子荧光分光光度计 化学化工学院 荆俊杰 分子发光分析法 分子发光分析包括: 荧光分析（fluorescence analysis） 磷光分析（phosphorescence analysis） 化学发光分析（chemiluminescence analysis） 该类分析方法与吸收分光光度法有密切关系。 分子发光分析法 若分子吸收了光能而被激发支较高能态，在返回基态时，发射出与吸收光波长相等或不等的辐射，这种现象称为光致发光，荧光分析和磷光分析是基于这类光致发光现象而建交起来的分析方法。 分子发光分析法 该类分析方法与吸收分光光度法有密切关系。 当物质分子吸收辐射能而被激发到较高电子能态之后，在返回基态的过程中，要释放出部分能量。 一、荧光分析法 物质的基态分子受一激发光源的照射，被激发至激发态后，在返回基态时，发射出与吸收光波长相等或较长的荧光。若物质分子用X射线或红外光激发，则分别产生X射线荧光或外光荧光。 一、荧光分析法 通常所指的分子荧光是指紫外-可见光荧光，即利用某些物质受到紫外光照射后，发射出比吸收的紫外光波长相等或更长的紫外荧光或可见荧光，通过测定物质分子产生的荧光强度进行分析的方法称为荧光分析。 二、荧光分析法的应用 荧光分析可应用于物质的定性检测及定量分析。由于物质结构不同，所能吸收的紫外光波长不同，在返回基态时，所发射的荧光波长也不同，利用这个性质可以鉴别物质。对于同种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度呈线性关系，利用这个性质可进行定量分析。 二、荧光分析法的应用 荧光法主要应用在医学检验、生物医学、药物、环境监测、食品分析等方面，尤其对体内活性物质及药物代谢物的测定更为重要。 三、荧光分析法的特点 荧光法的主要特点： 1）灵敏度高，检出限为10-7-10-9g/ml，比紫外可见分光光度法高10~1000倍。 2）荧光法的选择性强，能吸收光的物质并不一定能产生荧光，且不同物质由于结构不同，虽吸收同一波长，产生的荧光强度也不同。 3）它还有用样量少、操作简便等的优点。 荧光法的缺点是，由于许多物质不发射荧光，因此使它的应用范围受到限制。 四、荧光法的基本原理 1）激发光谱和荧光光谱 2）激发光谱和荧光光谱的的形状及其关系 3）物质的分子结构和荧光的关系 4）环境对荧光的影响 1）激发光谱和荧光光谱 任何发射荧光的物质都具有两个特征光谱，即发射光谱（excitation spectrum）和荧光光谱(fluorescence spectrum)。它们是荧光分析中定性和定量的基础。 荧光物质的最大激发波长（λex）和最大荧光波长（λem）是鉴别物质的根据，也是定量测定时的最灵敏的条件。 1）激发光谱和荧光光谱 激发光谱 ： 如果将激发光的光源用单色器分光，测定不同波长的激发光的照射下，荧光最强处荧光强度的变化，以激发波长（λ）为横坐标，荧光强度（IF）为纵坐标作图，便可得到荧光物质的激发光谱。 1）激发光谱和荧光光谱 荧光光谱 ：固定激发光波长和强度，而让物质发射的荧光通过单色器分光，以测定不同波长的荧光强度。以荧光波长（λ）为横坐标，荧光强度（IF）为纵坐标作 图，便可得到荧光物质的荧光光谱。 2）激发光谱和荧光光谱的的形状及其关系 荧光物质的激发光谱和荧光光谱形状相似。这是因为物质分子吸收了一定波长的紫外光后，才能发射出荧光。吸收越多，发射的荧光强度也越强。 一般把激发光谱看作是荧光物质的表观吸收光谱。激发光谱和荧光光谱呈现大致的镜像对称关系。 3）物质的分子结构和荧光的关系 了解荧光和物质分子结构的关系，可以帮助我们考虑如何将非荧光物质转化为荧光物质或将荧光强度不大或选择性不高的物质转化为荧光强度大及选择性高的荧光物质，以提高分析的效果。 3）物质的分子结构和荧光的关系 物质的分子结构与荧光的发生及荧光强度的大小紧密相关。 分子产生荧光必须具备2个条件： （1）物质分子必须具有能吸收一定频率紫外光的特定结构 （2）物质分子吸收了特征频率的辐射能之后，必须具有较高的荧光效率。荧光效率大，在相同的浓度下，荧光的发射强度也大。 3）物质的分子结构和荧光的关系 1、具有共轭双键体系的分子。共轭程度越大，分子的荧光效率越大。 2、具有刚性平面结构的分子。刚性的不饱和的平面结构具