补肾对冻存后自体移植小鼠卵巢功能影响的研究-中医妇科学专业论文.docx

万方数据 万方数据 摘 要 卵巢冷冻移植技术对女性生殖细胞的保存和利用具有应用价值。近年来发展 迅速。在该领域，中医药研究尚在起步阶段。本实验目的：研究补肾对冻存后自 体异位移植卵巢卵泡存活和卵泡发育的影响并探讨其作用机制。方法：本研究以 肾主生殖理论为指导，将小鼠冷冻复苏卵巢自体异位移植，异位移植小鼠随机分 为六组，分别为五子衍宗丸组（五子组）、左归丸组（左归组）、右归丸组（右归 组）、PMSG组、模型组和正常组，并采取术前、术后和全程用药3种不同给药方式， 以同期模型组为对照，移植后7、21和35天回收移植卵巢组织，采用组织学、免 疫组化、体外成熟、体外受精和实时定量PCR等方法对冻存后自体异位移植卵巢 卵泡生长、卵母细胞发育和相关基因表达进行研究。结果如下： 一 补肾对冻存后自体异位移植小鼠卵巢体内发育的影响 本次实验摘除卵巢再移植小鼠246只，摘除冻存移植卵巢492个。有效回收卵 巢338个，冻存移植卵巢总有效回收率为68.70%。移植卵巢7d、21d和35d，各组 卵巢回收率与模型组比较表明：五子衍宗丸显著提高冻存卵巢自体异位移植后的 存活率（p＜0.01）；移植前使用五子衍宗丸提高冻存后自体异位移植卵巢的存活 率（p＜0.05）； PMSG提高冻存卵巢自体异位移植后的存活率（p＜0.05）。 卵巢自体异位移植第7天，各组冻存后自体异位移植卵巢都未观察到窦状卵 泡和排卵前卵泡，移植第21天和第35天，自体异位移植卵巢观察到原始卵泡、初 级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡等各级卵泡生长，五子衍宗丸组最显著。 自体异位移植卵巢组织经VEGF免疫组化方法检测，移植第七天，自体异位移 3 植卵巢组织皮质及其外周组织VEGF表达有不同程度的增加。移植21天和35天，在 各级卵泡细胞和颗粒细胞之外的间质细胞VEGF有增强表达。 TUNEL细胞凋亡原位检测（FITC标记）冻存后自体异位移植卵巢组织，7d组 中，细胞凋亡阳性表达面积广泛，21d和35d组中，随着移植卵巢卵泡逐渐生长， 凋亡阳性细胞的表达区间逐步缩小，间质是凋亡阳性细胞的主要表达部位。 卵巢移植后第21天，五子衍宗丸组血清雌二醇（3.26±0.17 ng/ml）水平最 高，且与模型组、左归组和右归组比较有统计学差异（p＜0.05），表明五子衍宗 丸较左、右归丸能够更好的促进自体异位移植卵巢组织卵泡发育。 二 补肾对冻存后自体异位移植小鼠卵巢卵母细胞体外发育的影响 自体异位移植卵巢第21天和第35天，各组冻存后自体异位移植卵巢共回收卵 母细胞64枚和69枚，仅五子衍宗丸组回收有GV期和MⅡ期卵母细胞，细胞形态与 正常组回收卵母细胞一致。各组卵母细胞数量与模型组比较，表明五子衍宗丸、 右归丸和PMSG提高冻存卵巢自体异位移植后卵母细胞数量（p＜0.05）；随给药次 数增加，五子衍宗丸和右归丸促进移植卵巢功能进一步恢复，数量增加（p＜0.05）。 本次实验，五子衍宗丸组未成熟卵母细胞经体外培养后发育到MⅡ期，成熟 卵母细胞经体外受精，发育到2-细胞和桑葚胚阶段。表明五子衍宗丸不仅提高冻 存卵巢自体异位移植后卵母细胞数量，还可有效恢复冻存后自体异位移植卵巢卵 母细胞的发育能力。 三 补肾对冻存后自体异位移植小鼠卵巢卵泡生长发育相关基因表 达的影响 4 冻存移植卵巢和正常卵巢均可检测到目的基因GDF-9、AMH、FSHR、LHR、VEGF、 Ang2、Bax、Bcl-2、fas和fasl mRNA的表达。通过检测各组目的基因，与模型组 比较，通过细胞凋亡Bcl-2/Bax通路和血管新生调节通路，五子衍宗丸改善早期 冻存后自体异位移植卵巢卵泡细胞的生存状态和发育能力；通过卵泡生长和分化 相关通路，五子衍宗丸、右归丸改善晚期自体异位移植卵巢卵泡细胞的生存状态 和发育能力；五子衍宗丸和右归丸保护冻存后自体异位移植卵巢原始卵泡储备力； 移植前使用五子衍宗丸有效保护早期小鼠自体异位移植卵巢卵泡生殖发育能力。 结论：补肾可填精衍宗，肾精足，则肾气充，气血盛，从而保护冻存后自体 异位移植卵巢的生殖功能和内分泌功能。 关键词：补肾，五子衍宗丸/左归丸/右归丸，卵巢，冷冻保存，自体移植， 凋亡，血管新生，体外培养，治未病 5 6 Effect of “TONIFYING KIDNEY” on functions of auto-transplanted ovaries after cryopreservation in mice Abstract Ovarian cryopreservation and transplantation have clinical application value for conservation and utilization of female germ cell