间斑寇蛛卵粒毒素分离纯化和生物学特性分析.pdfVIP

摘要 ta tus)俗称黑寡妇蜘蛛或黑毒蜘蛛， 间斑寇蛛(三．tredeoYmgut 是一种中型蜘蛛。在分类学上隶属于节肢动物门，蛛形纲，蜘蛛目， 球蛛科，寇蛛属。间斑寇蛛是目前世界上己知毒性最强的蜘蛛之一， 与其他有毒动物不同的是，不仅在其毒腺毒液中存在毒性成分，而且 在身体的其他组织(如腿、腹部组织等)以及卵粒中也存在毒性成分。 二十世纪七十年代，美国学者采用化学与生物药理学等方法对间斑寇 幼蛛和成蛛的蛛卵粒和腹部等组织中的毒性成分进行了初步的分离 纯化研究，但到目前为止还没有对间斑寇蛛卵粒毒素成分进行系统分 离纯化和结构与功能分析的相关报道。在本文中，我们采用溶液抽提 方式获得卵粒提取物，对提取物的生物学活性等特征做了较为详细的 研究；采用凝胶过滤层析和离子交换层析等方法对卵粒提取物中的蛋 白质与多肽类成分进行了分离纯化研究，并对分离纯化得到的活性成 分进行了结构与功能研究。 蛋白质定量测定表明，间斑寇蛛卵粒提取物干物质蛋白质含量 为34．23％。卵粒提取物对小鼠具有较强的毒性，腹腔注射小鼠的LD。。 值为3．23 mg／kg。小鼠经腹腔注射卵粒提取物后，出现昏睡，体温 下降，身体蜷缩，呼吸急促，活动力减弱，身体抽搐，喘式呼吸，大 小便失禁，尾巴发紫，毛发皱褶等一系列症状。酶活性分析发现卵粒 提取物具有多种酶活性，包括透明质酸酶、乙酰胆碱酯酶、酸性磷酸 u 酶、碱性磷酸酶、蛋白水解酶等。电生理实验发现，250g／mL卵 粒提取物可以在12．0±1．5 min内完全阻断小鼠膈神经一膈肌标本的 神经肌肉的接头信号传递。用台式液洗涤后再刺激膈神经，发现这种 阻断效应可以部分消除。 用SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳对卵粒提取物进行分离后图像分析 发现卵粒提取物中分子量大于10kDa的蛋白质含量丰富，而分子量 低于10kDa的低分子量蛋白质和多肽含量较少。从图像上可以看到 8个染色较深的蛋白质条带以及10个以上染色较淡的蛋白质条带。 S-100 在随后的凝胶过滤层析中，卵粒提取物通过Sephacryl High Resolution Hiprep26／60柱分离得到7个组分(命名为P1--P?)， 通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现分子量不同的组分得到了较 好的分离。其中PI～P4为分子量大于i0kDa的大分子蛋白质成分， P5～P7为分子量小于10kDa的低分子量成分。通过电生理检测发现， 大分子成分都能阻断小鼠膈神经一膈肌的神经肌肉传递。当加入1．15 mg／mL的P1成分时，完全阻断时间为17．0min，用台式液漂洗不能 消除其阻断效应：分别加入1．50mg／mL的P2成分或1．33mg／mL的 P3成分后，都能在30min内完全阻断神经肌肉传导，台式液漂洗都 能恢复电刺激引起的膈肌收缩。而P4成分毒性较弱，添加1．10mg／mL min。 的P4成分后，其阻断时间超过80 随后，我们通过DEAE离子交换对P3中的成分进行了进一步的 P3-2，P3-4(约20kDa)在SDS—PAGE电泳中显示单一蛋白质条带， 提示蛋白质成分已得到有效的分离纯化。利用电生理、N末端测序和 蛋白质组学方法等多种策略对纯化的蛋白质进行了系统的结构与功 能分析。电生理活性分析发现，P3-1成分不能阻断膈神经一膈肌接头 u 传导。P3—4成分浓度为1．26×10叫g／mL(约6．3mol／L)时，能 在40min内完全阻断小鼠膈神经一膈肌标本的神经肌肉信号的传递， 用台氏液洗涤可部分消除这种阻断效应。此外，膜片钳实验结果表明， 测序获得了P3-4成分N-端的部分氨基酸序列为