酵母双杂交筛选PAK4相互作用蛋白质及PAK4和P37相互作用验证.pdfVIP

·中文著论摘要· 酵母双杂交筛选PAK4相互作用蛋白质及PAK4与 P37相互作用的验证 前言 P21活化激酶(P21．activatedkinase，PAK)为一类进化上保守的丝氨酸／苏氨 和细胞外信号的下游主要靶蛋白，参与多种重要细胞活动。PAK家族共有6个家 族成员：皆含有氨基末端(N．末端)调节区和羧基末端(C．末端)激酶区。根据 (PAK4．PAK6)。两类PAK在结构、活化方式、生物学功能上有着很大的区别， 它们具有不同的下游靶蛋白。 PAK4是目前研究的最为广泛的II类PAK，其在许多生物学活动如细胞骨架 重排、细胞迁移、细胞凋亡中发挥重要作用。鉴于p触“在细胞内信号转导通路 中的重要作用，本实验室利用酵母双杂交技术从人胎脑eDNA文库中筛选出了若 干个PAK4新的相互作用蛋白，并选取了一种较为感兴趣的蛋白P37，验证二者 在体内的相互作用。 (MPN)，并与转录、翻译，蛋白酶体的调控有关。目前，P37在翻译起始复合 体中的具体作用并未得知，但已知P37对细胞的生长非常重要，缺失此基因的细胞 蛋白质合成总量将明显下降。此外，P37具有泛素化酶的活性正向调节Notch信号 通路。P37的发现为P舢“肿瘤信号通路的进一步完善提供了新的依据，本课题旨 在证实PAK4与P37的相互作用关系，为将来探讨其生物学功能奠定基础。 实验材料与方法 一、实验材料 (一)基因克隆相关分子生物学试剂 (二)酵母双杂交和酵母蛋白、质粒提取相关试剂 二、实验方法 鉴定 (二)在AHl09酵母菌株中验证融合蛋白的表达 (三)顺序转染法筛选PAK4相互作用蛋白 (四)对阳性克隆进行测序 (五)分析阳性克隆的测序结果 (六)免疫共沉淀验证PAK4与P37在体内相互作用 用 结果 和Western 达融合蛋白质，利用酵母杂交方法筛选出了多个与PAK4蛋白质相互作用的 白质，它们分别与蛋白质翻译翻译、肿瘤的发生与发展、诱导干扰素产生、蛋白 质的泛素化、成骨、调控神经元的发育／维持／存活等相关。我们选取较为感兴趣的 P37蛋白，利用免疫共沉淀实验验证了两者在体内的相互作用。 结论昌日¨： 筛选出若干与PAK4相互作用的新蛋白，它们分别与蛋白质翻译翻译、肿瘤 的发生与发展、诱导干扰素产生、蛋白质的泛素化、成骨、调控神经元的发育／维 持／存活等相关。选取感兴趣的蛋白P37通过IP实验证实PAK4与P37在体内能够相 互作用。 2 关键词 PAK4；酵母双杂交；P37 3 ·英文论著摘要· rofdinteractioninteractmnnwitwithaPAK4FAK4antl Screeninl眨forproteinsproteins ；onfirnthe‘nteractiontlleinteractionoIofPAK4ffAK4witllwith7 Ob 1- 2Peviactivatedtcei．oneofthe conservedfamiliesof kinase(PAK)isevolutionarily serine／threoninekinases．PAK in a