工业酿酒酵母木糖代谢途径的建立及酒精发酵初步研究.docVIP

工业酿酒酵母木糖代谢途径的建立及酒精发酵初步研究 甘蔗糖业2007年第3期SugarcaneandCanesugar2007年6月 工业酿酒酵母木糖代谢途径的建立及酒精发酵 初步研究木 郭亭梁达奉鲍晓明一 (1广州甘蔗糖业研究所广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室,广州510316; 2山东大学微生物技术国家重点实验室,济南2501O0) 摘要以酵母AS2.1190为出发菌株,把含有木糖还原酶基因(XYL1),木糖醇脱氢酶基因(以及 木酮糖激酶基因(X/S1)的质粒载体pYMIKP—xyl27线性化后多拷贝整合进入其基因组,筛选得到基因工程 菌株GZ4—127,并对此工程菌株进行葡萄糖,木糖共发酵试验.结果显示GZ4-127比出发菌株的菌体密 度提高5%,木糖消耗提高2倍,酒精产率提高12%,说明工程菌已能够有效地利用木糖生产乙醇. 关键词酿酒酵母;木糖;燃料乙醇 0前言 在化石能源渐趋枯竭,以及在对可持续发展, 保护环境和发展循环经济的追求中,世界开始将 目光聚焦到以丰富的,可再生的纤维素为原料, 生产更加安全,环保和高性价比的能源,以期部 分替代化石能源和石化产品.用纤维质原料生产 乙醇是未来燃料乙醇的发展方向.目前,美国, 巴西等国已制定大力发展燃料乙醇的政策,利用 玉米,甘蔗和其它木质纤维素材料等生物质原料 生产乙醇.由于糖厂蔗渣原料比较集中,易于收 集和处理,因而,蔗渣生产燃料乙醇已成为国内 外研究的热点…. 目前,蔗渣等生物质纤维酒精生产工艺的生 产成本还不能达到有经济效益的水平.主要的技 术难题是纤维的预处理与酶解效率较低和缺少能 充分利用纤维水解液中各种糖类成分的,具有良 好工业生产性能的微生物发酵菌株.在纤维素 原料水解液中,木糖的含量为30%左右,是继葡 萄糖之后自然界中最丰富的糖分.促进木糖向乙 醇的生物转化是充分利用纤维素生物质,降低乙 醇生产成本的关键环节之一.酿酒酵母是传统的 乙醇生产工业菌株,具有易培养,乙醇耐受度高, 耐高糖浓度,耐发酵抑制剂能力较强及厌氧发酵 等优良性状,但是其不能利用木糖生产酒精.因 而,在酿酒酵母中构建木糖代谢途径是这一方向 的研究重点. AS2.1190是甘蔗糖蜜酒精发酵的优良菌种, 适应性强,发酵性能稳定,成熟醪含酒分较高, 并且对营养分的要求不高.本文以AS2.1190作为 出发菌株,在其中建立木糖代谢途径,并对工程 菌株GZ4—127进行初步酒精发酵研究. 1材料与方法 1.1菌株与质粒 酿酒酵母AS2.1190系广州甘蔗糖业研究所 ?基金项目:广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室启动项目甘蔗渣预处理技术及酒精发酵工艺研究. 作者简介:郭亭(1981一),男,硕士,研究方向:微生物遗传与分子生物学;鲍晓明,女,教授,通讯作者, 主要研究微生物遗传与分子生物学. 郭亭等:工业酿酒酵母木糖代谢途径的建立及酒精发酵初步研究 保藏,质粒pYIMKP-xyl27系山东大学鲍晓明实验 室构建,其质粒物理图谱见图1. HindⅢ Sa/I 图1质粒pYIMKP—xyl27的物理图谱 1.2试剂 限制性内切酶,TaqDNA聚合酶(上海博尚生 物技术公司,BioAsia),质粒小量提取试剂盒(朋 远生物技术有限公司),酵母粉,胰蛋白胨 (OXOID),其它化学试剂均为国产分析纯. 1.3培养基 大肠杆菌用LB培养基,添加50~g/mL氨苄 青霉素.酿酒酵母用YPD培养基,添加不同浓度 的G418用于筛选酵母转化子.酒精发酵用培养基 胰蛋白胨(2%),酵母粉(1%),葡萄糖(5%),使 用前加入10oA的木糖. 1.4分子生物学操作 常规分子生物学操作参照文献和试剂公司提 供的操作手册进行. 酿酒酵母转化采用LiAc完整细胞转化法, 酿酒酵母转化液涂布于含G418的YPD培养基上, 筛选转化子. 1.5重组酿酒酵母酒精发酵 发酵条件:将活化的种子液按10%(v/v)的 接种量分别接种于含1O0mL发酵培养基的500mL 三角瓶中,30℃厌氧发酵. 菌体浓度测定:将菌液适当稀释后在600hill 下测定吸光度值,即onO0. 1.6重组酿酒酵母菌株酒精发酵产物的分析 发酵液样品经0.45m醋酸纤维滤膜过滤后, 用高效液相层析(HPLC)分析其中葡萄糖,木糖, 木糖醇,乙醇含量.层析柱用AmineHPX一87H (Bi0一Rad,USA)离子交换柱,流动相为5mmo1/L Hzs0,流速0.4mL/min,柱温55℃.用折光检测 仪RIO-1OA(Shimadzu,Japan)进行检测. 2结果与讨论 2.1质粒pYIMKP-xyl27的制备与酶切 制备质粒pYIMKP-xy127以后,用限制性内切 酶aI对其进行线性化,结果见图2.图中可以 看出,含有木糖代谢相关基因的整合型质粒 pYIM