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均匀的设计优化建兰ISSRPCR的体系 　　摘 要：采用均匀设计，对影响建兰ISSR―PCR体系的引物、Mg2+、dNTP和Taq DNA聚合酶浓度等进行4因素5水平和4因素3水平两轮优化，建立了适合于建兰ISSR-PCR的反应体系：在20μL反应体系中，含引物0.25tLmol/L、Mg2+2.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶1.5U和模板DNA 40ng.在此基础上对扩增程序中的循环次数和退火温度，以及ISSR引物进行筛选，筛选获得的扩增程序为：94℃预变性5min；接着进行32个循环：94℃变性35s，52－56℃退火45s，72℃延伸90s；循环结束后，72℃延伸10min.同时筛选得到14个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。 　　关键词：建兰；ISSR―PCR；均匀设计 　　中图分类号：Q949.662 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007-7847(2007)01-0058-06 　　 　　建兰(Cymbidium ensifolium(Linn.)Sw.)为兰科(Drchidaceae)兰属(Cymbidium)植物，极具观赏和经济价值，兰科植物广泛分布于各种生态环境，表现有高度特异的形态、结构和生理特性，建兰也不例外，长期的自然杂交以及人工选育，品种间存在很高的遗传分化和种间类型，这为杂交育种选配亲本提供了丰富的种质资源；但同时，仅凭花色、花型、叶色、叶型、花梗等传统的形态指标来辩识品种，则存在很大难度，这不仅给品种的整理和研究带来困难，同时也影响新品种的注册登录和产权保护。 　　以DNA指纹图谱为指标的分子标记技术，标记的位点数远大于形态标记和生化标记，且不易受环境因素的影响，可弥补或解决形态标记和生化标记中的缺陷或难题，因此，被广泛用于植物品种的鉴定，ISSR(inter-simple sequence repeat，简单序列重复区间)是Zietkiewicz等在SSR(simplesequence repeat，简单序列重复)基础上创建的，基于PCR技术的一种新型分子标记，其基本原理是利用真核生物基因组中广泛存在的SSR来设计引物，而无需预先克隆和测序，用于ISSR-PCR扩增的引物通常为16－18个碱基序列，其主体是2－4个碱基组成的串联重复序列，然后在其5′端或3’端加上1－4个锚定碱基，引起特定位点退火，使引物与相匹配的SSR的一端结合，从而保证ISSR引物能够对SSR之间的DNA序列进行PCR扩增，ISSR分子标记操作简单，可揭示的多态性较RAPD和RFLP、SSR高，重复性较RAPD好。成本较AFLP低，目前已广泛用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、生物进化及分子生态学研究等，显示出了广阔的应用前景。 　　然而，ISSR分子标记是基于PCR技术的，其反应结果同样受诸多因素的影响，因此在应用IS-SR标记技术时，需针对研究的物种，对ISSR-PCR体系和扩增程序进行优化，以期获得多态性高、稳定性好的扩增结果，确保标记的可靠性，优化IS-SR-PCR体系和扩增程序，目前大多采用单因子试验法，即依经验确定一个起始条件，然后依次调整某个因素，使实验结果接近最佳，单因素试验忽略了因素间的综合效应，结果很难达到预期的最优化，均匀设计是在正交设计的基础上发展起来的一种适用于多因素多水平的试验设计方法，与正交设计对比，均匀设计只考虑试验点在试验范围内的均匀分散，而忽略了整齐对比，其特点是任何一个因素的诸个水平作相同数目的试验，因此，试验次数大大减少，本研究采用均匀设计，对影响ISSR-PCR的主要因素Mg2+、dNTP、引物以及Taq DNA聚合酶浓度等分别进行5水平和3水平两轮优化实验，获得建兰ISSR-PCR体系的优化组合，并在此基础上对ISSR-PCR扩增程序中的退火温度和反应循环次数进行比较筛选，旨在建立适合于建兰的ISSR-PCR条件，进一步为建兰的品种鉴定、种质资源保护和分子辅助育种等的研究奠定基础。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 材料 　　实验所用建兰样本取自福建省龙岩市连城县朋口镇福建兰花基地，用手术剪剪取建兰嫩叶，蒸馏水冲洗干净，凉干水分，称0.2g于已灭菌的研钵中，加2mL SDS高盐提取介质和少量石英砂，迅速研磨，匀浆移至离心管，置冰盒中带回实验室，-18℃冰箱保存。 　　 　　1.2 DNA提取和质量检测 　　建兰DNA提取和质量检测按文献[11]进行， 　　 　　1.3 ISSR-PCR体系优化 　　参考有关DNA模板浓度对ISSR-PCR体系的影响，发现ISSR-PCR对DNA模板浓度不甚敏感，在20μL反应体系中20－60ng的模板均能有稳定而清晰的扩增，为此，本实验在2