医学实验动物学第六章人类疾病动物模型和免疫缺陷动物.ppt

转基因动物的应用 1在遗传研究中的应用：治疗遗传病或产生某种疾病用以研究发病机理。 2在肿瘤学研究中的应用：研究原癌基因的激活、抑制的调控机理，抗肿瘤药物筛选等。 3在免疫学研究中的应用：用转基因小鼠模型研究免疫球蛋白的表达、免疫球蛋白的多样性以及T、B、NK细胞作用等，还为研究I和II类主要组织相容性抗原的功能提供了新的手段。 4在培养动物新品种中的应用： 遗传信息在同种或亲缘很近才能发生交换，大部分是通过突变来选择的。 5在基因治疗研究中的应用：校正遗传疾病，但转入的基因的整合位点以及整合后将改变人类的基因库，存在伦理和技术上的难题。 6生物反应器：转基因技术是瓶颈，产生的转基因动物效率低，目的基因的表达低。 转基因动物技术的主要步骤 获取外源目的基因 外源目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物 转基因胚胎的发育及鉴定 筛选所得的转基因动物 目的基因的制备 目的基因：是指准备导入受体细胞内的，以研究或应用为目的所需要的外源基因称目的基因。目前获得目的基因有4条途径： 1.从生物基因组群体中分离目的基因原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因。 2.人工合成目的基因DNA片段??? 人工合成目的基因DNA片段有化学合成和酶促合成法两条途径。一般是采用DNA合成仪来合成长度不是很大的DNA片段。 3.PCR反应合成DNA??? 聚合酶链式反应（PCR)是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的。通过PCR技术获取所需要的特异DNA片段在实际应用用得非常多，但是前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。 4.mRNA差异显示法(mRNA differential display, DD)获得目的基因??? 原理是先用PCR技术扩增所有的mRNA、生成cDNA群体，再用测序凝胶电泳获取所需要的目的基因，然后再次用PCR扩增。简单的讲，就是从基因的转录产物mRNA来反转录成cDNA作为目的基因。 5、用机械的方法，例如超声波把基因组打成片段。 目的基因的扩增 通过载体在宿主中克隆 通过PCR扩增目的基因 目的基因的导入 ○ 脂质体介导法 · 脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂类双分子层围成的囊状结构 · 形成囊状结构可将DNA包在其中 · 带有外源DNA的脂质体通过细胞的内吞作用进入受体细胞，达到基因转移的目的 ○ 血影细胞介导法 · 血影细胞：哺乳动物细胞溶血，使血红蛋白大量逸出，最后成为仅有被细胞膜包被的细胞核结构 · 血红蛋白大量逸出时，外源DNA也容易进入。让血影细胞与受体细胞在适当条件下发生细胞融合，从而使外源DNA导入受体细胞 ○ 电转移法 受体细胞与外源DNA按一定比例混合后，放入电脉冲槽中，经用脉冲电压刺激，外源DNA即可进入细胞（或受精卵） 目前应用于生产转基因动物的方法 -原核显微注射 生殖细胞载体法 反转录病毒转染 体细胞核移植 胚胎干细胞技术 应用较早并且被公认和成熟的技术 最具应用潜力的并且也是目前发展最快的技术 原核注射 显微注射法是最早建立的转基因方法，也是目前使用最为广泛、最为有效的方法。其优点是:基因的转移率高，整合效率可达30%:可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移;外源基因的长度不受限制，可达几百kb;常常能得到纯系动物;实验周期相对比较短。 外源基因 基因微注射 移植受精卵 小鼠出生 转基因鼠的检测 繁殖后代 A :准备注射的原核清晰的卵母细胞 B:注射过程 C: 注射后的卵母细胞 D: 吸取基因注射液 转GFP绿色荧光胚胎 转GFP绿色荧光胚胎 生殖细胞载体技术 有体外和体内转染生殖细胞的两种方法，前者又包括精子载体法、卵子载体法、受精卵载体法、胞浆内精子注射法等。 精子载体法是将成熟的精子与外源DNA的载体共同孵育，使精子携带外源DNA，受精后外源DNA整合至染色体中。此法理论上是可行的、也有成功的先例，但成功率不高、效果不稳定，有待继续探索、完善。 逆转录病毒转染 将目的基因重组到逆转录病毒RNA载体上,制成高滴度的病毒颗粒,人为感染着床前或着床后的胚胎,也可以让胚胎与能释放逆转录病毒的单培养层细胞共孵育以达到感染的目的。逆转录病毒RNA进入寄主细胞后,被反转录为DNA,并在整合酶和其末端特殊核酸序列作用下整合到寄主细胞的基因组进行表达和遗传,得到转基因动物。 目的基因 逆转录病毒 卵母细胞 成熟卵母细胞 精子 导入 感