生物35－二基水杨酸比色法测定还原糖和总糖.pptVIP

3，5－二硝基水杨酸比色法测定还原糖和总糖 一、目的 掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。 二、原理 1)还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。 2)还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在520nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 三、 试剂 1）1mg/mL葡萄糖标准液　　准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。 2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 　　　将6.3g DNS和262mL 2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。 四、操作方法：（一）葡萄糖标准曲线的制定１）取九支试管，分别按下表加入试剂 项目 0 1 2 3 4 5 6 7 8 葡萄糖标准液(mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 相当于葡萄糖量（mg） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 蒸馏水（mL） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.4 1.0 0.8 0.6 0.4 3，5-二消基水杨酸试剂（mL） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 ２）将各管溶液混匀，在沸水中加热5分钟，取出后立即用冷水冷却至室温，再向每管加入21.5mL蒸馏水，摇匀。 ３）于520nm波长处测A值。以葡萄糖mg数为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 （二）样品中总糖和还原糖含量的测定 １）样品中还原糖的提取：准确称取2g山芋粉，放在100mL烧杯中，先以少量水调成糊状，然后加50－60mL蒸馏水，于50℃恒温水浴中保温20分钟，过滤，将滤液收集在100mL容量瓶中，再定容至100mL。 　２）样品中总糖的水解及提取：准确称取1g山芋粉，放在锥形瓶中，加10mL6mol/L盐酸，15mL水，在沸水浴中加热半小时，取出一、二滴置于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈蓝色。冷却后加入1滴酚酞指示剂，以10%氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色，过滤并定容到100mL。再精确吸取上述溶液10mL于100mL容量瓶中，定容至刻度，混匀备用。 ３）样品中糖含量的测定：取7支试管分别按下表加入试剂： 项目 空白 还原糖 总糖 0 1 2 3 4 5 6 样品溶液(mL) 0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 蒸馏水(mL) 2 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 3，5-二消基水杨酸(mL) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 加完试剂后，其余操作与制作标准曲线时相同。 ４）测定后，取样品的A平均值在标准曲线上查出相应的糖量。用下式计算出山芋粉中还原糖与总糖的百分含量。