PCR技术与应用教学讲义.pptVIP

5条引物的详细序列 RT Primer： 5’-(p)AAAATGACCCAG- 3’ F1 Primer： 5’-GTCCTGTGGATCCTCTACGC- 3’ R1 Primer： 5’-AGCCACTATCGACTACGCGAT- 3’ F2 Primer： 5’-AGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTG- 3’ R2 Primer： 5’-CTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATA- 3’ Step1. 反转录反应 RNA Mixture 10×RT Buffer RNase Inhibitor (40 U/ml) AMV Reverse Transcriptase XL (5 U/ml) 5’ 磷标记反转录引物 (200 pmol/ml) RNase Free dH2O up to 30℃ 10 分钟→ 50℃ 30 分钟→ 80℃ 2 分钟→4℃ 保存 1.反应液组成: 2.反应条件: 3.0 mg 1.5 ml 0.5 ml 1.0 ml 1.0 ml 15 ml Step2. Hybrid RNA的分解 1st Strand cDNA反应液 5×Hybrid RNA Degeneration Buffer RNase H (60 U/ml) dH2O up to 30℃; 1 小时→乙醇沉淀 1.反应液组成: 2.反应条件: 15 ml 15 ml 1 ml 75 ml Step3. 单链 cDNA 的自身连接反应 Step2 的 cDNA 沉淀物 5×RNA (ssDNA) Ligation Buffer dH2O 40% PEG#6000 T4 RNA Ligase (40 U/ml) 16℃; 过夜反应 1.反应液组成: 2.反应条件: 8 ml 12 ml 20 ml 1 ml Step4. PCR 反应 (1st PCR) Step3 的连接反应液 10×LA PCR Buffer II dNTP Mixture (2.5 mM each) Primer F1 (20 mM) Primer R1 (20 mM) TaKaRa LA Taq (5 U/ml) dH2O up to 1.反应液组成: 2.反应条件如下: 1.0 ml 5.0 ml 8.0 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 50 ml 94℃ 3 min 94℃ 30 sec 55℃ 30 sec 72℃ 30 sec 25 Cycles Step4. PCR 反应 (2nd PCR) 1st PCR 反应液 10×LA PCR Buffer II dNTP Mixture (2.5 mM each) Primer F2 (20 mM) Primer R2 (20 mM) TaKaRa LA Taq (5 U/ml) dH2O up to 1.反应液组成: 2.反应条件如下: 1.0 ml 5.0 ml 8.0 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 50 ml 94℃ 30 sec 55℃ 30 sec 72℃ 30 sec 30 Cycles 2nd PCR反应结果 M 1 M : DL2000 Marker 1 ：PCR产物 ●切胶回收电泳结果如下 1 ：回收DNA片段 M ：DL2000 Marker 1 M Step5. 目的 DNA 片段的切胶回收 Step 6. DNA 片段的序列测定 未知 序列 5’ 3’ 测序结果与五条引物间的关系 PSPtet RNA的5’端序列 AATACAAGCTTGGGCTGCAGGTCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGG