金黄色葡萄球菌双组分系统反应调节蛋白AgrA的原核表达纯化及活性.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３５（５）：３２４０ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 金黄色葡萄球菌双组分系统反应调节蛋白 ＡｇｒＡ的原核表达、纯化及活性鉴定 １ ２，３ ２，３ ２，３ ２，３ ２，３ 张旭宁 　权春善 　廖颖玲 　柳科欢 　熊　文 　范圣第 （１大连工业大学生物工程学院　大连　１１６０３４） （２大连民族学院生物技术与资源利用国家民委教育部重点实验室　大连　１１６６００） （３大连民族学院生命科学学院　大连　１１６６００） 摘要　ＡｇｒＡ作为金黄色葡萄球菌双组分信号转导系统（ｔｗｏｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ， ＴＣＳＴ）的反应调节因子，能调控细菌毒力因子的表达，在金黄色葡萄球菌致病过程中起着重要的 作用。采用无限制克隆法构建ＡｇｒＡ表达载体，在ＡｇｒＡ蛋白的Ｃ端融合绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）标 签，通过实时监测ＧＦＰ的荧光强度来快速检测重组蛋白的表达水平。首先利用单因素实验，筛选 出宿主菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰｌｙｓＳ；其次，结合ＢｏｘＢｅｈｎｋｅｎ试验设计，筛选出最优蛋白质表达条件： 诱导时间为２２ｈ、转速为２２２ｒ／ｍｉｎ、诱导剂浓度为０．５ｍｍｏｌ／Ｌ，ＡｇｒＡ产量达到５．５６ｍｇ／Ｌ。最后，基 于ＡｇｒＡ蛋白ＬｙｔＴＲ区域的非放射性凝胶阻滞实验（ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｍｏｂｉｌｉｔｙｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ，ＥＭＳＡ）验证了ＡｇｒＡ的生物活性。提出了反应调节蛋白ＡｇｒＡ在大肠杆菌高效可溶性表达 的策略，为双组分信号转导系统的体外研究奠定基础，也为其他反应调节蛋白的可溶性表达与分 离纯化提供了一个可行借鉴。 关键词　金黄色葡萄球菌　ＡｇｒＡ　ＧＦＰ　响应面分析　ＥＭＳＡ 中图分类号　Ｑ７８ 　　金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性菌，在自然界分 　　ＡｇｒＡ蛋白的 Ｃ端包含一个能与 ＤＮＡ结合的 ［９］ 布广泛，可通过多种不同途径传播，能引起人和动物的感 ＬｙｔＴＲ区域 ，该区域存在于许多常见的致病菌中，但 ［１３］ 是在人体中并未发现 ＬｙｔＴＲ同源序列。因此，如果能 染 。随着抗生素的广泛使用，出现越来越多的耐药金 黄色葡萄球菌株，并且呈现多重耐药性的趋势。金黄色 够以ＬｙｔＴＲ区域为靶点，找到一种能够抑制 ＡｇｒＡ与 葡萄球菌的致病性与其毒力因子有关，而毒力因子的释 ＤＮＡ结合的化合物，从而阻断ａｇｒ系统信号通路，将为 放主要受附属基因调节系统（ａｃｃｅｓｓｏｒｙｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｏｒ， 金黄色葡萄球菌感染的治疗和新药的开发提供新的途 ［４］ ａｇｒ）调控 。ａｇｒ系统包含一个由信号转导因子ＡｇｒＣ和 径。然而，在ＡｇｒＡ异源表达过程中，往往在获得高水 反应调节子 ＡｇｒＡ组成 的双组分信号转导系统 平表达的同时，容易被宿主蛋白酶降解或形成包涵体， ［５］ （ＴＳＣＴ） 。膜蛋白ＡｇｒＣ作为信号转导因子，能被外界 不利于目的蛋白功能活性的研究。这一过程主要受载 环境中的同源信号分子ＡＩＰ激活，发生自我磷酸化，磷酸 体、宿主菌株、培养基成分及外源蛋白表达速率等因素 化的ＡｇｒＣ将磷酸基团转移给ＡｇｒＡ使其磷酸化，活化后 ［１０］ 影响 。为了获得高表达量的可溶性ＡｇｒＡ，本文首先 的ＡｇｒＡ可以与下游启动子ＲＮＡＩＩ和ＲＮＡＩＩＩ间的重复序 将ＧＦＰ蛋白融合至ＡｇｒＡ蛋白末端作为报