基因工程在食品工业中的应用培训讲学.pptVIP

第二章 基因工程原理及其在食品工业中的应用 ; 4.重组DNA技术（recombinant DNA technique） 利用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同的DNA进行体外切割、连接构成新的DNA分子的技术。 5.基因工程（gene engineering） 运用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同DNA进行体外切割、连接构成重组DNA，再将重组DNA经生物介导或直接导入等转移方法引入受体细胞进行克隆、表达，从而改变生物遗传性以创造生物新种质，或通过大量扩增为人类提供有用产品等的技术。 6.食品基因工程 利用基因工程的技术和手段，在分子水平上定向重组遗传物质，以改良食品的品质和性状，提高食品的营养价值、贮藏价格性状以及感官性状的技术。;;（二）基因工程的基本操作程序 1.运用合适的方法从生物体中分离或通过化学合成制备目的基因。 2.采用合适的方法将目的基因与合适的载体进行体外连接，构建重组DNA。 3.利用合适的方法将重组DNA导入受体生物细胞以获得转化体。 4.采用合适的方法筛选出重组转化体阳性克隆。 5.运用合适的方法对重组转化体阳性克隆进一步分析以及操作，使目的基因在受体生物细胞中高效表达。 ;（三）基因工程的三大理论和三大技术基础 1.三大理论基础 （1）1940年代Avery等人的肺炎球菌的转化试验证明了生物的遗传物质是DNA。 （2）1950年代Watson和Crick发现了DNA分子的双螺旋结构及DNA半保留复制机理。 （3）1960年代Crick关于遗传中心法则的确立，即生物体中遗传信息是按DNA→RNA→蛋白质方向进行传递。 2.三大技术基础 （1）如何从生物体庞大的双链DNA分子中将所需要的基因片段切割下来（限制性内切核酸酶）。 （2）如何将获得的基因片段进行连接（DNA连接酶）。 （3）如何将切割下来的基因片段进行繁殖扩增（基因载体）。;二、基因工程的工具酶 ;（一）限制性内切核酸酶与DNA甲基化酶 1.限制作用与修饰作用 限制作用（restriction）：指一定类型的细菌可以通过其限制性内切核酸酶的作用，切割降解入侵的外源DNA，使得外源DNA的入侵受到限制的现象。 修饰作用（modification）：指在DNA甲基化酶作用下，生物体自身DNA分子在特定碱基的特定位置上发生甲基化而得到修饰，从而免遭自身限制性内切核酸酶降解的现象。; 2.限制性内切核酸酶与DNA甲基化酶 限制性内切核酸酶（restriction endonuclease）：简称限制酶，指一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷酸序列的内切核酸酶。 DNA甲基化酶（DNA methylase）：简称甲基化酶，指一类能够识别DNA特定序列，并在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶。; 3.限制性内切核酸酶的类型 （1）Ⅰ型。由三种不同亚基组成；辅助因子为ATP、Mg2+及S-腺苷甲硫氨酸；切割位点距其识别位点至少1 000bp；切割作用随机。Ⅰ型限制酶不宜作为基因工程的工具酶。 （2）Ⅱ型。由两个相同亚基组成；辅助因子仅为Mg2+；识别位点常具旋转对称性；切割位点与其识别位点重叠或在其附近；切割作用特异性强。Ⅱ型限制酶是基因工程理想的工具酶。 （3）Ⅲ型。由两种不同亚基组成；辅助因子为ATP和Mg2+，也受S-腺苷甲硫氨酸激活，但并非必需；切割位点一般在距其识别位点3’端24～26bp处。Ⅲ型限制酶在基因工程中也不常用。 ; 限制性内切核酸酶没有种属特异性，即限制性内切核酸酶识别、切割特定序列的能力同底物DNA的来源无关，它可识别、切割各种来源的DNA。 DNA甲基化酶具有种属特异性，生物体的DNA甲基化酶只修饰保护自己的DNA，而不修饰保护非己的DNA。生物体的限制性内切核酸酶不能降解自身被修饰保护的DNA，而只能降解外源的DNA。 ;表4-1 限制性内切核酸酶的类型及主要特性 ; 4.Ⅱ型限制性内切核酸酶的切割方式 在识别序列双链DNA两条链的对称轴上同时切断磷酸二酯键，形成双链平齐末端。 在识别序列双链DNA两条链的对称轴两侧同时从3’端切断磷酸二酯键，形成3’-羟基端2～5个核苷酸突出单链黏性末端。 在识别序列双链DNA两条链的对称轴两侧同时从5’端切断磷酸二酯键，形成5’-磷酸端2～5个核苷酸突出单链黏性末端。;; 5.影响限制性核酸内切酶活性的主要因素 （1）底物DNA制备物的纯度 蛋白质、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙