藏药红景天中查尔酮合成酶基因的克隆与分析 生物物理学专业论文.docxVIP

分类号 密级 UDC 注1  学 位 论 文 藏药红景天中查尔酮合成酶基因的克隆与分析 （题名和副题名） 肖 燕 （作者姓名） 指导教师姓名 杨足君 教 授 电子科技大学 成 都 （职务、职称、学位、单位名称及地址） 申请专业学位级别 硕 士 专业名称 生 物 物 理 学 论文提交日期 2008.4 论文答辩日期 2008.5 学位授予单位和日期 电子科技大学 答辩委员会主席 评阅人 2008 年 月 日 注 1：注明《国际十进分类法 UDC》的类号。 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得电子科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 签名： 日期： 年 月 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解电子科技大学有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权电子科技大学可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解密后应遵守此规定） 签名： 导师签名： 日期： 年 月 日 摘 摘 要 摘 摘 要 I I PAGE PAGE IV 摘 要 红景天是传统的常用中药之一，具有重要的药用价值，其中黄酮类化合物是 红景天中的主要有效成份。近年来对黄酮类化合物的研究，特别是如何提高药用 植物中黄酮的含量已经成为研究的热点与难点。对于提高黄酮的相对百分含量的 研究，前人已有大量的报道，事实证明采用生理生化途径调控黄酮相对百分含量 是一种有效的方法。同时，利用植物基因工程技术对植物进行遗传改良或在分子 水平上调控植物黄酮合成途径中关键酶的活性，从而提高黄酮含量也是一种行之 有效的方法。黄酮的合成代谢中涉及到十几种酶，而查尔酮合成酶（ chalcone synthase，CHS）是红景天黄酮合成代谢途径中的关键酶。因而，开展红景天查尔 酮合成酶的研究具有重要的理论意义与实践价值。 本研究以此为基础，以长鞭红景天为实验材料，采用改进的 CTAB 法提取 DNA 和 RNA。利用 RT－PCR 技术提取出 cDNA，利用一对简并引物分离出查尔酮合成 酶基因的部分序列，采用单侧寡聚核苷酸嵌套 PCR(single oligonucleotide nested PCR，SON－PCR)方法从红景天中分离出查尔酮合成酶基因的 DNA 全长序列。再 利用组织培养得到的红景天进行黄酮含量测定，得到的主要结果如下： 1．采用实验室改进的 CTAB 法提取红景天的 DNA 和 RNA，提取的 DNA 经 电泳检测，有清晰的主带，说明提取的 DNA 质量较好。抽提的 RNA 经紫外吸收 测量，A260/A280 接近 2.0；反转录合成的 cDNA 经引物扩增，出现清晰的条带， 说明提取的 RNA 与 DNA 的纯度高，质量好。该法简便易行，适合于富含多糖， 多酚植物材料的核酸提取。 2．采用 1 对简并引物，以红景天 DNA 为模板进行 PCR 扩增，得到了 860 bp 的 CHS 的基因片段，GenBank 登录号为：EF070214。 3．利用 SON－PCR 技术首次从红景天中分离出黄酮合成代谢的第一个关键酶 基因 CHS 基因，命名为 Rhchs，其序列全长为 2 443 bp，包括 682 bp 的启动子区、 1 143 bp 的编码区和 3’ UTR 区。预测序列编码 381 个氨基酸，其氨基酸组成与其 他已知的高等植物的查尔酮合成酶具有很高的同源性，与葡萄、山茶花、杜鹃和 牵牛的同源性分别为 87 %、87 %、86 %、85 %，且大部分氨基酸序列保守。 4．将本研究获得的查尔酮合成酶基因的保守序列与另外 10 个物种的序列进 行比对与聚类分析，结果发现 11 个物种共分为 3 个相似类群，其中同属于单子叶 植物的构成了一个分支，属于十字花科的植物构成另一个分支；长春花、柑橘、 胡桃和杜鹃花构成一个类群；而红景天和覆盆子构成一个分支，可以推定红景天 查尔酮合成酶与此物种具有较高的相似性。 5．红景天查尔酮合成酶基因（Rhchs）的组织结构分析显示由 2 个外显子和 1 个内含子组成，起始密码子（ATG）和终止密码子（TAA）分别位于第 1 个外显 子和第 2 个外显子内。且第二个外显子比第一个外显子更长更保守。 6．根据红景天查尔酮合成酶基因（Rhchs）序