产核黄素枯草芽孢杆菌的代谢工程研究-生物化工专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 摘要 本研究以通过逆向代谢工程方法重构的枯草芽孢杆菌 BS110 为出发菌株， 应用理性代谢工程方法从增强核黄素生物合成途径相关基因的表达，增加前体物 GTP 的供给，改进能量代谢等几个方面构建高产核黄素的枯草芽孢杆菌，最后 工程菌核黄素产量达到 4.2 g/L，得率达到 40 mg/g 葡萄糖。 首先对枯草芽孢杆菌 BS110 工程菌的嘌呤途径进行代谢工程改造，增加前 体物 GTP 的供给。敲除 guaC 基因，阻断 GMP 合成 IMP 途径；进一步过表达 prs 和 ywlF 基因，提高 PRPP 和核糖-5-磷酸的浓度，增加进入嘌呤途径的代谢通 量；最后过表达 guaB 基因，增强 IMP 合成 GMP 的代谢通量，构建工程菌 BS118； 摇瓶发酵，菌株 BS118 核黄素产量达到 1194.95 ± 45.58 mg/L，得率达到 11.61 ± 0.47 mg/g 葡萄糖。与出发菌株 BS110 相比，核黄素的产量和得率分别提高 44.6% 和 37.2%。 以嘌呤途径代谢工程修饰的 BS118 菌株为基础，对其呼吸链进行代谢工程 改造，以提高工程菌的能量利用效率。敲除能量利用效率偏低的编码 bd 氧化酶 的 cyd 基因，构建工程菌 BS119；摇瓶发酵，菌株 BS119 核黄素产量达到 1296 ± 34.03 mg/L，核黄素的得率达到 11.72 ± 0.05 mg/g 葡萄糖。提高菌体的能量利用 效率后并没有显著提高核黄素的产量，很有可能是因为，对于工程菌 BS119 来 说，核黄素生物合成基因的表达量是限制核黄素合成能力的因素。 进一步通过增加核黄素操纵子的剂量和阻断孢子形成途径，以提高核黄素的 生物合成能力。在工程菌 BS119 基因组淀粉水解酶基因位点整合一个核黄素操 纵子，构建工程菌 BS120，工程菌 BS120 核黄素摇瓶发酵产量达到 1854 ± 31.87 mg/L；在 BS120 基础上敲除 sigE 基因，阻断孢子的形成，核黄素得率提高 13%； 同时在 BS120 基础上，转入 pMX45 游离型质粒以及在基因组上进行核黄素操纵 子的串联扩增，构建工程菌 BS125。工程菌 BS125 核黄素产量达到 4.2 g/L，得 率达到 40 mg/g 葡萄糖。工程菌 BS125 较出发菌株 BS110 核黄素产量提高了 408%，核黄素得率较出发菌株 BS110 提高了 373%。 关键词：枯草芽孢杆菌 核黄素 嘌呤途径 呼吸链 核黄素操纵子 代谢工 程 Abstract In this study, focusing on overexpressing riboflavin biosynthetic genes, increasing the supply of GTP which is the precursor of riboflavin and modifying respiratory chain, B. subtilis BS110 (lab stock) was engineered as the starting strain and modified to increase the riboflavin biosynthis by metabolic engineering. Finally, the riboflavin production of engineering strain reached 4.2 g/L and riboflavin yield reached 40 mg/g glucose. Purine pathway of BS110 was engineered genetically with the purpose of increasing the supply of GTP. Knockout guaC gene, blocking the pathway of GMP to IMP; Overexpress prs and ywlF genes, improve concentration of PRPP and ribulose-5-phosphate (Ru-5-P) increasing the flux to purine pathway; At last, guaB gene was overexpressed by promotor replacement enhance the flux from IMP to GMP, creating engineering strain BS118; Strain BS118 produced 1194.95 ± 45.58 mg/L riboflavin an