污水处理中氨氧化古菌富集培养.ppt

污水处理系统中氨氧化古菌的 富集培养以及性质 目录 CONTENTS 1 文章背景 2 材料方法 3 结果 4 讨论 1 文章背景 文章背景 硝化反应在氮循环中起着重要作用，同时也是污水处理系统脱氮的关键反应。氨氧化反应是硝化反应的第一步，也是其中的限速步骤。一直以来该步骤都被认为是由氨氧化细菌( Ammonia-oxidizing bacteria，AOB) 独自参与的。然而近年来研究发现，参与氨氧化反应的微生物还有另外一个大的类群，即氨氧化古菌 ( Ammonia-oxidizing archaea，AOA )。 AOA 属于古菌中的奇古菌门 ( Thaumarchaeota)，与 AOB 在进化归属，生理生化特性方面存在较大差异，但二者参与氨氧化过程的部分基因是同源的。其中应用最多的是编码氨单加氧酶α亚基的 amoA 基因，以该基因作为指示，发现 AOA 广泛分布于海洋、土壤、热泉以及污水处理系统等环境中，是氨氧化过程的重要参与者。与 AOB 相比较，AOA 对于底物氨氮和氧具有较高的亲和力，这使得 AOA 在低氨氮和低溶解氧条件下依然能够有较好的氨氮去除效果。 当前国内外的研究主要以调研和统计 AOA 的分布情况为主，对 AOA 进行富集和分离的研究仍然较少。由于古菌本身生长缓慢，受环境波动影响大，富集和分离较为困难。目前已报道的纯培养 AOA 只有两株: 海洋亚硝化短小杆菌 ( Nitrosopumilus maritimus) 和维也纳亚硝化球菌( Nitrososphaera viennensis) ，此外富集培养的 AOA 有 8 株。这些菌株都是从海洋沉积物、土壤、热泉等自然环境中富集得到。到目前为止，还没有从污水处理系统( 活性污泥) 中富集分离 AOA 的报道。污水处理系统依靠氨氧化反应来去除氨氮，研究者在国内外多个污水处理系统中均发现了 AOA，在部分系统中，AOA 的数量甚至超过 AOB 几个数量级。但与 AOB 不同的是，并非每一个氨氮去除效果良好的系统中都能发现 AOA 的存在。研究者对于影响 AOA 存在性的因素做出了多种不同的猜测，包括氨氮浓度、溶解氧、盐度、停留时间等。由于缺乏来源于污水处理系统的富集菌株，上述猜测无法通过直接的微生物学实验证实，仅停留在调研和统计阶段。 本文针对上述存在的问题，从污水处理系统中富集得到高纯度的 AOA，经过系统发育鉴定之后，确认其中仅含有一种 AOA，之后对其生长特性和代谢特性进行了研究。本研究对深入了解污水处理系统中 AOA 的独特性质，探究 AOA 在污水处理系统中的存在条件具有重要参考价值。 文章背景 2 材料方法 采用的液体培养基包含 NH4Cl(0.5mmol/L)，KH2PO4 (0.1mmol/L)，NaHCO3 (2.5mmol/L)，1%污泥上清液(原始污泥离心后取上清，过0. 2μm 滤膜( GTTP，millipore) 除菌，提供必须的微量元素和维生素等物质)。用1mol/L的HCl调pH至6. 5，121℃灭菌20min。之后加入氨苄青霉素(50mg/L) 以及链霉素(25mg/L)。后续的生长和代谢试验采用的培养基与富集一致。 2 材料方法 活性污泥取自天津市某污水处理厂HJ，该厂采用BDP生物倍增工艺，进水氨氮80－300 mg/L，出水氨氮小于1mg/L，污泥浓度6000－8000mg/L。取样点溶解氧浓度为0.6 mg/L。取样后将污泥置于冰盒中暂时保存，带回实验室后立即开始接种培养。 PCＲ仪 (S1000，伯乐) 定量 PCＲ 仪 (iQ5 Multicolor，伯乐) 变性梯度凝胶电泳系统(Decode DGGE，伯乐)， 凝胶成像仪 (Gel Doc XＲ，伯乐) 紫外分光光度计 (DＲ5000，哈希) 环境扫描电子显微镜 (Quanta200，FEI) 2 材料方法 生长和代谢参数计算 扫描电镜分析 16S rＲNA 基因和 amoA 基因的检测及系统发育分析 AOA 的富集培养 16S rＲNA 基因和 amoA 基因的定量 古 菌 16S rＲNA 基 因 变 性 梯 度 凝 胶 电 泳( DGGE) 分析 3 结果 AOA的富集效果检测 富集 AOA 的系统发育鉴定 将克隆文库得到的古菌16S rＲNA基因序列(1439bp)用BLAST数据库比对，做出的系统发育树如图2所示。本研究富集得到的HJ-2b菌与之前报道的Nitrososphaera sp．JG1最为接近，在覆盖度为94%时序列相似度为 100%;其次与Nitrososphaera evergladensisSＲ1较为接近，覆盖度99%时，序列相似度为99%。依据16S rＲNA基因进化关系进行鉴定，HJ-2b菌与上述两株已报道