PCR引物设计及测序结果分析-医学课件.pptVIP

Primer Premier 5.0使用介绍 Preimer Premier 启动界面 Load sequence * Sequence name Original sequence Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DNA seq 8种密码子偏好 Choose a function 引物设计界面 * 引物设计界面 First you can design the primer manually Sense strand or anti-sense strand Useful information of the primer * 引物搜索选项设定 引物类型 搜索模式 5’引物位置范围 3’引物位置范围 产物大小范围 引物长度 * 基本分子生物学研究手段 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? PCR PCR反应液体的成分: PCR循环的程序: PCR原理： * 基本分子生物学研究手段 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? RT-PCR 反转录PCR mRNA---cDNA-----PCR * 基本分子生物学研究手段 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? Cutting by enzymes * 基本分子生物学研究手段 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? Southern Blot * 基本分子生物学研究手段 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? Northern Blot * * PCR技术的基本过程 模板DNA dNTP 引物 Buffer 预变性 模板DNA dNTP 引物 Buffer TaqDNA聚合酶 循环仪 94oC 5’ 94℃ 55 ℃ 72 ℃ * 模板与引物的复性,引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。 Tm 在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA 94?C 从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链 72?C 变性 退火 延伸 * * PCR出现的问题： PCR扩增未得到目的条带？ 扩增出目的条带之外的多条带（非特异性）？ 扩增的目的条带很弱？ 引物是否合适? 引物设计是PCR 技术中至关重要的一环 * PCR结果分析 PCR结果。1－2、PCR产物（3ul样品） * PCR常见问题 1. 无扩增产物 模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 退火温度太高 * 2. 非特异性扩增 引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 退火温度偏低 循环次数过多 *