免疫共沉淀常见问题解析.PDFVIP

活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 免疫共沉淀常见问题解析 1. 免疫共沉淀中的 input 是指什么 ？ 答 ：input 是阳性对照 2. Co-ip实验两个抗体需要不同种源吗 答 ：最好选择两个不同种源的抗体。选择同一种源的抗体的问题在于 ：在 WB之前进行的蛋白变性这一步 ，由于加 样缓冲液中含有巯基乙醇 ，巯基乙醇会把抗体的重链和轻链之间的二硫键破坏 ，从而使的抗体变成重链分子 55KD 和轻链分子 25KD。假设你 IP的抗体是兔抗的 ，目的蛋白进行 WB的抗体也是兔抗的 ，而且目的蛋白的分子量为 55KD ，可以想象 ，55KD的位置除了你的目的蛋白以外 ，还有 IP抗体的重链 IgG。由于 IP的抗体用量非常大（1ug ）， 就导致 55KD处的信号会非常强。如果你用抗兔的二抗进行显色 ，那么 55KD处的 ip抗体的重链和你的目的蛋白 会重叠在一起 ，无法分辨。 然而这个时候如果你的目的蛋白进行 WB的抗体不是兔抗的 ，比如小鼠抗的 ，那么就需要用抗小鼠的二抗进行显色 ， 而抗小鼠的二抗是无法跟兔抗的 IP抗体发生反应的。因此 55KD位置的IP抗体的重链 IgG就无法显色 ，发生反应 的就是你的目的蛋白了。 3. 免疫共沉淀如何避免假阳性 ？ 答 ：若抗体浓度高 ，则降低抗体浓度 ；若抗体特异性不好 ，则换抗体 ；若 PCR污染 ，则重新配置缓冲溶液。 4. 免疫共沉淀中 ProteinA/G琼脂糖珠有何作用 ？ 答 ：ProteinA/G 能特异性地结合到免疫球蛋白的 FC 片段 ，因此能和抗体结合 ，而抗体与目标蛋白结合 ，目标蛋白 和相互作用的蛋白结合。 5. Co-ip实验中使用的对照抗体有哪些 ？ 单克隆抗体 ：正常小鼠的IgG或另一类单抗; 多克隆抗体 ：正常兔 IgG 6. 免疫共沉淀阴性对照的意义是什么 ？ Tel:(025) 5889-4959 www.DetaiB Sales@DetaiB 活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 答 ：排出污染的可能性 ，例如检测一个兔子细胞的某种蛋白质 ，若没有设置 LgG 的对照 ，而操作中有非特异性蛋 白质 ，又和设计的抗体有作用 ，就会出现阳性的结果。如果做了阴性对照 ，也就是 lgG对照 ，对照没有出现阳性就 说明没有非特异性的蛋白 ，对照出现阳性 ，说明抗体有非特异结合的可能 ，需要重新开始实验。 7. Co-ip实验中如何去除重链轻链的影响 ？ 答 ：用兔的 lgG做对照 ；用抗 Fab和 Fc抗体特异性封闭轻链和重链 ；在 WB二抗上着手 ，这种二抗针对的是轻重 链间的二硫键 ，若跑 SDS胶 ，最后显影是检测不到重链和轻链的。 8. 免疫共沉淀中没有检测到与目的蛋白相互作用的蛋白或检测得到的信号太弱 ？ 答 ：裂解液中的去垢剂浓度太高或配方过于剧烈 ：此时降低去垢剂浓度或更换去垢剂种类 ； 受蛋白的亚细胞定位影响 ：应重新选择裂解液配方来释放目的蛋白 ； 蛋白与蛋白之间的相互作用太弱或不太稳定 ：应选择亲和力更高的抗体以捕获更多的目的蛋白 ，从而捕获更多的相 互作用蛋白 ；过表达提高目的蛋白的含量 ：选择目的蛋白或相互作用蛋白含量高的样品进行免疫共沉淀实验。 9. 免疫共沉淀与免疫沉淀的区别 免疫共沉淀 免疫沉淀 免疫沉淀 （immunoprecipitation ）是指利用抗体可与抗原特异性结合的特性 ，将抗原 （常为靶蛋白 ）从混合体系 沉淀下来 ，初步分离靶蛋白的一种方法。 免疫共沉淀 （coimmunoprecipitation ）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。 其原理非常简单 ，如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话 ，那么当用一种蛋白的