TRIZOL法提取总RNA-15博.pptVIP

转化率：转化细胞/细胞总数 影响因素： 载体：载体性质、空间结构、分子大小等 受体细胞 转化过程 * 本次课程整体安排 10.19 上午 总RNA提取、核酸定量、RT 下午 PCR、凝胶电泳 10.20 上午 转化 10.21 上午 ELISA分析实验 10.21 下午 实时荧光定量PCR 10.22 下午 定量标准曲线的绘制级分析 10.23 上午 细胞传代 10.27 上午 脂质体转染细胞 10.28 上午 结果观察、分析 10.28 下午 考试 实验总体安排 ? 大鼠GAPDH基因的钓取、克隆和鉴定： 大鼠肝细胞总RNA的提取，凝胶电泳检测 GAPDH基因的RT-PCR扩增（普通聚合酶） 质粒转化 TRIZOL法提取总RNA 简介 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。 RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。 Trizol是直接从细胞或组织中提取总RNA 的试剂，内含异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来。异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶，保持RNA 的完整性。在酚和氯仿作用下离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，用异丙醇沉淀水中的RNA。 RNase 它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。 RNase的又一污染源是取液器，包括枪头和EP管等 RNase处理 所有玻璃器皿均应于使用前180℃干烤3h或更长时间，塑料器皿可用0.1％DEPC浸泡或用氯仿洗涤。 全部实验过程最好戴一次性手套，接触可能污染了RNA酶的物品后，应更换手套。 配制的溶液应尽可能用0.1％DEPC在37℃处理12h以上，然后高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，用经DEPC处理过的无菌蒸馏水配制，然后用0.22um滤膜过滤除菌。 从组织中提取RNA 本实验目的：提取大鼠总RNA 组织来源：大鼠肝脏。 每组做两个样品 步骤 解剖大鼠肝脏，每个样品取50-100mg组织，立即加入1mlTRIZOL试剂。匀浆。 移入1.5ml Ep管中，室温静置5min。 每1ml TRIZOL中加氯仿0.2ml，摇振15s，置室温2～3min。 4℃离心，12,000g×15min。 仔细吸取上层水相，移至另一Ep管中。 加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min。 4℃离心，12,000g×10min。 弃上清，加75％乙醇1ml，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4℃离心，7500g×5min。 弃上清，空气干燥5-10min，加入50μl无RNase水重悬沉淀。 核酸定量或电泳检测。多余样品-70℃保存备用。 注意事项 抽提及操作RNA中要谨防RNase的污染，因此操作RNA的试剂及器皿都要进行相应的处理。 全部实验过程最好戴一次性手套，接触可能污染了RNA酶的物品后，应更换手套 样品量和Trizol 的加入量一定要按比例，不能随意增加样品量或减少Trizol 量，否则会使内源性RNase 的抑制不完全，导致RNA 降解。 电泳检测 琼脂糖凝胶电泳是检测和分离核酸的常用方法 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖浓度。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。 溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 注意事项 EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样。 实验步骤 （1） 0.25g 琼脂糖加入25ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。 （2）冷却到60℃，加入1μl的0.5mg/ml EB，并摇匀。 （3）将将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。 （4）将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。 （5）用移液器吸取总RNA样品5μl于封口膜上，再加入1μl 的6Xloading buffer，混匀后，小心加入点样孔。 (6) 打开电源开关，调节电压至3-5V