脑心通06号对血管平滑肌细胞增殖影响课题研究科会西安交大.pptVIP

脑心通对氧化低密度脂蛋白诱导血管平滑肌细胞增殖的影响 研究者: 娄莉 王东琦 研究单位: 西安交大一附院 实验背景 正常状态下,平滑肌细胞的功能主要是通过不断收缩与松弛起到调节血流的作用.在一些刺激作用下(如脂蛋白的作用,由损伤引起的炎症反应)平滑肌细胞可出现表型的改变,细胞呈收缩型向合成型的转换. 当处于合成型,平滑肌细胞通过表面的受体接受外来生长因子的调节而大量增殖,由中膜向内膜迁移,在内膜增生,合成包括胶原蛋白,弹性纤维和多糖等大量细胞外基质. 使得平滑肌细胞在动脉粥样硬化的纤维性增生中起重要作用. 实验背景 ox-LDL通过诱发一系列与细胞增殖有关的反应,包括增加原癌基因(如c-fos,c-sis基因)的表达,刺激内皮细胞,单核巨噬细胞,血小板和增生的平滑肌细胞自身释放大量的生长因子和细胞因子,促进平滑肌细胞增殖. 实验背景 一些离体实验提示他汀类药物可以直接或间接参与平滑肌细胞凋亡,并且在24小时观察到细胞周期停滞于G1 期. 氟伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀和西伐他汀(cerivastatin)均呈剂量依赖性抑制鼠和人VSMC增殖 抑制人股动脉VSMC增殖的他汀类药物浓度比较如下:西伐他汀洛伐他汀≈辛伐他汀≈阿托伐他汀≈氟伐他汀普伐他汀 流式细胞仪检测发现,10-4mol/L的氟伐他汀抑制人和猪VSMC G/S期转换,使其仅为对照组的50%。 张敬贤等在临床对照研究中观察到脑心通可改善心绞痛临床症状,有调脂抗氧化的双重作用,； 张加力观察到脑心通对患者血清C-反应蛋白(CRP)有明显干预作用。 刘思泰,李德才,云红梅等认为脑心通胶囊对缓解冠心病不稳定心绞痛有明显的疗效,其机理可能是通过改善血管内皮功能,降低ET水平和促进NO释放而发挥作用;也可能与其改善血管壁慢性炎症有关。 ? 张敬贤等.步长脑心通治疗冠心病合并血脂紊乱的疗效观察, 中国中药杂志,2002,9,27,9:705~706 ?杨君玲?步长脑心通治疗冠心病心绞痛60例报告,山东医药,2004,44,23:51~52 ?张加力,杜立树等. 脑心通胶囊对87例冠心病患者血清CPR的影响, JTCM. 2006,Vol.47,No.6:472 刘思泰,李德才,云红梅等. 脑心通对不稳定型心绞痛患者血管内皮功能及超敏C反应蛋白的影响,中药药理与临床,2007,23(3):77~79 实验目的 用阿托伐他汀做对照,观察在体外实验中脑心通是否对平滑肌细胞增殖有抑制作用,并探讨其可能机制． 实验方法 实验用SMCs，分为6组： 1 空白对照组 2 ox-LDL组 3 ox - LDL +阿托伐他汀组( 终浓度10-4mol/l) 4 ox - LDL +脑心通组( 终浓度1 g/ L) 5 ox - LDL +脑心通组( 终浓度0.5g/ L) 6 ox - LDL +脑心通组( 终浓度0. 1g/ L) 实验方法 培养48小时 终止培养 MTT比色法 比较各组OD值,间接反应活的平滑肌细胞数量 流式细胞仪测定DNA含量分析确定各组细胞中细胞周期G1期 S期 G2期所占百分数 观察加入不同药物对细胞在细胞周期运行过程中的影响 流式细胞仪Annexin-v-FITC和PI双标记细胞观察药物对细胞凋亡的作用 培养SMCs 实验结果 1.MTT检测细胞生长抑制率 2.流式细胞仪测各细胞周期百分数 3.流式细胞仪测细胞凋亡百分数 1. MTT 检测细胞生长抑制率 噻唑兰（MTT）可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性 MTT 还原为难溶于水的蓝紫色的针状结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。用阿托伐他汀和不同浓度脑心通作用24小时检测吸收值，并计算细胞生长抑制率。 与空白对照组相比, ox - LDL组OD值明显增加,VSMC表现为增殖状态(P0.01)。阿托伐他汀和脑心通（1g/L）均可抑制ox - LDL诱导的VSMC增殖(P0.01;P0.01)。脑心通的作用呈现剂量依赖的趋势(见表1)。 2.流式细胞仪检测细胞周期和细胞含量 流式细胞仪检测显示ox - LDL有促VSMCs增殖的作用，表现为G0/G1期的细胞比例显著降低，S期的细胞比例显著增高(与对照组相比P0.01)，阿托伐他汀和大剂量的脑心通均可增加G0/G1期细胞比例，降低S期的细胞比例，与ox - LDL组相比，差异有显著性(P0.05或P0.01) 3流式细胞仪检测细胞凋亡 在细胞凋亡早期，位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（AnnexinV）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它与PS具有高度的结合力。因此，An