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杂交水稻种子纯度检测的方法综述 　　摘要：建立准确、快速、经济的检测方法监控杂交水稻纯度对于保障我国水稻安全生产具有至关重要的作用。本文综述了用于杂交水稻纯度检测的各种方法，并对各种方法的优缺点进行了评述，总体来讲，我国杂交水稻纯度鉴定方法的发展趋势是由鉴定周期长向鉴定周期短，由鉴定程序复杂向简单，由成本高向成本低的方向发展。根据各种检测方法的特点，认为DNA分子标记技术和设计育种鉴定方法有较大发展空间，能满足准确、快速、经济的要求；实时荧光PCR技术具有美好的前景。 　　关键词：杂交水稻；种子纯度；检测；实时荧光PCR；DNA分子标计；设计育种 　　中图分类号： S511.03文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）06-006-05 　　自1976年杂交水稻在我国培育成功以来，其以明显的产量优势和广泛的生态适应性受到普遍欢迎，迅速在全国乃至世界范围推广开来[1-2]。当前杂交水稻种植面积约 1 667万hm2，约占我国水稻种植总面积的60%，累计增收稻谷逾4亿t，每年增产的粮食可多养活7 000万人[3]，为我国乃至世界的粮食安全作出了巨大贡献。杂交稻种子纯度是保障其增产的关键。杂交稻种子纯度是指杂交种子在特征特性方面典型一致的程度。由于杂交水稻制种环节多、周期长，在种子生产过程中生物学混杂和机械混杂时有发生，易导致杂交种不纯。有研究指出，在一定范围内，杂交稻纯度每下降1%，667 m2减产4～5 kg，纯度下降10%，杂交稻将失去其增产优势[4]，我国规定杂交水稻种子纯度不得低于96%。因此严格监控杂交稻种子质量，只允许合格种子进入市场和田间，对确保水稻增产具有重要意义。这其中建立准确、快速、经济的杂交种纯度检测方法对于种子质量监控具有重要意义。目前杂交种纯度检测主要有以下几种方法。 　　1海南种植鉴定法 　　利用海南冬季温光资源进行的田间种植鉴定是当前杂交稻纯度检测最常用的方法之一。海南种植鉴定结果直观且比较可靠，但种植环境条件的变化也可能引起某些假杂种与真杂种间难以区分，导致结果失真[5]。另一方面，该鉴定方法周期长，需要几个月时间，如果等待鉴定结果，再进行包装销售，将延误农民播种；如果隔年销售，将增加种子越夏的仓储费用，且储存不当会导致种子发芽率下降，将给种子公司的经营带来诸多麻烦。当前，采用海南种植鉴定的种子公司，在销售种子时，多数情况下并不知道种子真实纯度，只能凭借经验，根据天气和制种田的情况估计纯度，海南鉴定结果只作为售后参考，这给杂交水稻生产埋下了安全隐患，该行业也被称为高风险行业，流传“十年赚钱，不够一年赔”的说法。 　　2粒型鉴定法 　　粒型鉴定法通过观察种子的形态特征，与标准样品进行比较，判别种子真假，观察的主要性状有大小、形状、稃壳色、稃尖色、[JP3]稃毛长短和稀密、柱头色和夹持率等。其优点是简单、快速，但由于亲缘关系较近的种子在形态上很难区分，且同一品种内各种子形态并不完全一样，因此检验结果可靠性差[6]。 　　3苯酚染色法 　　苯酚会使不同品种的谷粒或米粒呈现不同的颜色。水稻品种的苯酚染色一直被用于籼粳亚种间种子的鉴别，通常籼稻易着色，而粳稻难着色，并表现出程度上的差异。该法对籼、粳亚种间颜色区别明显，但对亚种内的水稻区分不明显。同时，水稻种子成熟度不同，染色后颜色深浅也往往不一样，所以该方法鉴定杂交种纯度易造成人为误差或错误[7]。 　　4蛋白质电泳法 　　[JP2]由于遗传上的差异，作物不同品种间的蛋白质种类和含量不同。蛋白质电泳可将品种间的蛋白差异在凝胶上区别开来。20世纪60年代，蛋白质电泳技术即被应用到水稻等作物杂交种纯度检测。根据被检蛋白质的功能，可将其分为种子贮藏蛋白电泳和同工酶电泳两大类。目前用于纯度检测的种子贮藏蛋白主要有醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白和谷蛋白[8-12]。同工酶是指催化反应相同而结构及理化性质不同的一组酶，它们几乎存在于所有生物中。被用于品种纯度检测的同工酶主要有酯酶同工酶、过氧化物同工酶、磷酸酶同工酶等。陆士伟等最早报道应用幼苗酯酶同工酶测定杂交水稻种子纯度[13]。李卓杰等利用胚芽的酯酶同工酶等电聚焦电泳对汕优63、博优64等进行纯度鉴定[14]。颜启传应用种子及幼苗酯酶同工酶电泳鉴定多个杂交稻品种和亲本种子[15-16]。陶芳等利用汕优64、汕优63、特优559幼芽的酯酶同工酶谱带数量和深浅进行鉴定，结果与田间鉴定相差 1%～2%[17-18]。[JP] 　　蛋白质电泳在纯度鉴定中存在以下不足：（1）组织特异性强，不同发育阶段和不同组织的图谱差异大；（2）结果与操作过程相关，蛋白提取液、胶浓度和电泳系统不同，结果也会不同，导致难以形成统一标准[19-20]；（3）多态性少，对于亲缘关系较近的亲本及其杂交种难