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昆虫RNAi技术及其的应用 　　摘要　RNAi是近几年发展起来的抑制基因表达的新技术。部分昆虫存在RNAi信号的系统性传播现象。可以将dsRNA直接注射进昆虫的卵、血腔或局部组织，引发远距离靶基因的特异性沉默，建立起了Embryo RNAi，Larval RNAi，Adult RNAi，Parerttal RNAI，Feeding RNAi和基于转基因技术的可遗传RNAi等昆虫RNAi技术，使RNAi迅速成为了研究昆虫尤其是非模式昆虫基因功能的主要方法。文章拟就RNAi的系统性、昆虫RNAi技术及其应用进行综述。 　　关键词　RNAi，系统性基因沉默，昆虫，应用 　　 　　RNA干扰(RNA interference，RNAI)现象是指内源性或外源性双链RNA(double―strandedRNA，dgRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失。其发现可追溯到1990年，Napoli等向矮牵牛中导入更多拷贝与粉红色色素合成有关的基因以产生颜色更深的紫色矮牵牛花，结果许多花朵的颜色不但没有加深，反而变成白色或花白色。因为导人的基因和其同源的内源基因同时都被抑制，所以被称为共抑制(co-suppression)现象。这种共抑制现象被确认是发生在转录后水平，所以又被称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene sileneing，PrGS)。随后发现在真菌中的消除(quelling)现象以及动物的RNA干扰现象都属于转录后基因沉默现象。dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、植物、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼、大小鼠等多种生物中。 　　在植物和线虫中，RNAi信号能在细胞与细胞之间传播，引发多数组织细胞或全身性的RNAI效应称为系统性基因沉默(systemic genesilencing)。大多数昆虫也存在RNAi信号的系统性传播现象，可以将dsRNA直接注射进昆虫的卵、血腔或局部组织，引发远距离靶基因的特异性沉默。基于此，开发出了直接注射或饲喂dsRNA的适用于卵、幼虫、蛹及成虫各发育阶段的昆虫RNAi技术。有关RNAi现象的发现、RNAi作用的机制和特点等方面已经有很多综述，本文拟就RNAi的系统性、昆虫RNAi技术及其应用进行综述。 　　1　RNAi的系统性 　　 　　RNAi效应的系统性传播首先发现于植物。植物RNAi系统性沉默的主要功能被认为能在整个植物体转移病毒抗性，阻断病毒进一步感染。在线虫Caenorhabdhis elegans中dsRNA效应能扩散到未直接导入dsRNA的组织中。给线虫喂食能够产生dsRNA的大肠杆菌，不仅能在喂食的线虫本身产生强有力的RNAi应答，而且在其后代亦可以产生应答。某些昆虫也具有系统性基因沉默的现象，例如直接将dsRNA注射到赤拟谷盗Tribolium castanettm的血腔，可以引起远距离甚至子代基因的沉默。奇怪的是果蝇的RNAi却不具有系统性，不能全身性传递也不能传递给子代驯，除卵母细胞外其余组织或细胞也不能从胞外吸收dsRNA。 　　RNAi效应的系统性传播分为2个阶段：dsRNA的细胞吸收和RNAi效应的传播。Winston等通过诱变获得了c，elegans一种突变体，RNAi仅在咽部起作用，而不能向l晦近细胞扩散。他们从这种突变体中鉴定了3个具有系统性RNAi缺失(systemic RNA interferencedeficient，SID)的基因，分别命名为sid-l、sid-2和sid-3，并对sid-1进行了深入研究。生物信息学分析表明，si1基因编码1个776个氨基酸的疏水性蛋白，是一种跨膜蛋白，其结构包括1个信号肽序列和11个可能的跨膜结构域。用e-fp作报告基因发现SID-GFP融合蛋白主要集中在膜上，可能作为细胞吸收dsRNA的膜通道。果蝇中没有sid-1基因的同源物，将ski-1基因转入果蝇s2细胞，发现转基因的S2细胞具有从培养液中摄取dsRNA的能力，而且其摄取效率与dsRNA的长度呈正相关，说明S1D-1蛋白与dsRNA的细胞吸收有关。通过sid-1基因在线虫培养细胞中超表达的嵌合分析进一步证实S1D-1蛋白参与体细胞和种系细胞的dsRNA吸收。Tijsterman等在研究c，elegans系统性RNAi分子机制时，通过遗传突变的方法筛选到30个与系统性RNAi有关的突变并将其分为5个互补群：rsd2，rsd3，rsd4，rsd6和rsd8，即RNAi传播缺失(RNAi spreadingdefective)，分析发现rsd8与Winston等发现的sid基因为同一个基因，Rsd2，Rsd3和Rsd6与种系细胞中的系统性RNAi效应有关，而与体细胞的系统