储存红细胞内NO水平及microRNA表达变化研究-临床检验诊断学专业论文.docxVIP

目 录 HYPERLINK \l _bookmark0 中文摘要1 HYPERLINK \l _bookmark1 英文摘要5 HYPERLINK \l _bookmark2 中英文对照词汇表9 HYPERLINK \l _bookmark3 前 言11 材料和方法14 结 果27 讨 论 HYPERLINK \l _bookmark4 45 结 论52 HYPERLINK \l _bookmark5 参考文献53 HYPERLINK \l _bookmark6 综 述59 HYPERLINK \l _bookmark2 攻读学位期间的研究成果68 HYPERLINK \l _bookmark7 致 谢69 储存红细胞内 NO 水平及 microRNA 表达变化研究 研究生：解绪红 导 师：魏亚明 教授 中文摘要 研究背景 红细胞在体外储存过程中发生一系列生理生化、形态结构和功能变化，称 为“储存损伤”。因此，红细胞氧亲和性的降低，流变学及粘连性的改变会加重 局部缺血。一氧化氮（NO）具有强大的松弛血管平滑肌的作用，能扩张微小血 管，提高红细胞通过能力和携氧能力。研究表明红细胞储存损伤与 NO 含量快 速下降有关。有人将 NO 供体、NO 抑制剂等加入红细胞中孵育，发现 NO 供体 能使红细胞变形性增加，而 NO 抑制剂作用相反。NO 可穿过细胞膜与 Hb 结合 形成 S-亚硝基血红蛋白（SNO-Hb），与输送氧和血管舒缩功能有关。血液离体 后，SNO-Hb 含量就开始快速持续减少。有人把红细胞直接暴露在饱和 NO 液 体中，发现红细胞内 SNO-Hb 产生量显著增多。 微小核糖核酸 (miRNA) 是一类非编码内源性小单链 RNAs 分子，参与细 胞凋亡、分化和增殖等生命过程。初步研究发现红细胞内 miRNA 在储存过程 中出现明显变化趋势，有可能成为“储存损伤”的生物标志物。而人为添加 NO 供体，有可能改善储存红细胞中 NO 水平，影响 miRNA 表达，延长红细胞储存 时间、提高储存红细胞携氧能力。 目 的 研究储存红细胞内 NO 水平与 miRNA 表达变化，探索减轻红细胞体外低 温保存损伤的可能途径与机制。 方 法 1) 红细胞内 NO 浓度检测：血样采自 10 名健康献血者，制成悬浮红细胞， 1 分为新鲜红细胞组和储存红细胞组。新鲜红细胞组滤除白细胞后检测红细胞内 总 NO、胞浆 NO 浓度，Hb 结合 NO 浓度等于前者减去后者。储存红细胞组储 存 20 天时滤除白细胞，分为两部分，一部分与终浓度分别为 1、10μM SNP 孵 育，用全自动血液流变仪检测流变学各项指标；另一部分与终浓度分别为 0.2、 1、5、25μM SNP 孵育，检测红细胞内三种 NO 含量；根据上述结果并结合文 献确定合适的 SNP 添加浓度，为后续实验作准备。 2) MicroRNA 表达芯片及差异基因的筛选：送检新鲜悬浮红细胞组、储存 20 天悬浮红细胞组和储存 20 天悬浮红细胞添加 SNP 组去芯片公司进行基因芯 片检测，根据差异倍数≥2 和 P≤0.05 两个条件筛选出差异基因，并从中筛选出 有意义的 microRNAs 作 RT-qPCR 验证。 3) 通过预测软件对目的 miRNA 进行靶基因预测，筛选出与细胞凋亡、细 胞衰老、红细胞膜和 NO 代谢相关的 mRNAs 作 RT-qPCR 验证。 4) 分析 miRNA-mRNA 可能的靶向调控关系。 结 果 1) 流变学检测结果：储存红细胞与新鲜全血参考值比较，中切（高切） 还原粘度、聚集指数、刚性指数、变形指数、电泳指数均在新鲜全血参考值范 围内，其余大部分流变学指标均比新鲜全血低。储存红细胞添加 1 μM SNP 时， 各项流变学指标与未加 SNP 组相比均无统计学差异（P＞0.05）；当增加至 10 μM SNP 时，红细胞低切粘度、还原低切粘度、中切粘度、还原中切粘度、聚集指 数和电泳指数均显著低于未加 SNP 组（P＜0.05），变形指数和刚性指数无统计 学差异（P＞0.05）。 2) NO 检测结果：储存红细胞内总 NO、胞浆 NO 和 Hb 结合 NO（主要是 SNO-Hb）含量比新鲜红细胞内三种 NO 含量下降了 56.70%、59.03%和 55.55% （P＜0.05）。当储存红细胞添加 0.2 μM SNP 时，三种 NO 含量与未加 SNP 组 相比均无统计学差异（P＞0.05）；当 SNP 浓度增加至 1μM 时，红细胞内三种 NO 含量与未加 SNP 组相比分别增加了 32.92%、20.28%、64.76%（P＜0.05），Hb 结合 NO 浓度甚至接近新鲜红细胞水平（P＞0.05）；当增加至 5 μM 甚至 25 μM 时